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HPV18 E5蛋白稳定表达株的筛选及对细胞增殖和周期的影响
本研究筛选能稳定表达HPV18 E5蛋白的细胞株,并检测HPV18 E5蛋白对细胞增殖及周期的影响.通过PCR方法扩增得到HPV18E5基因,经酶切和连接构建含His标签的pSecTag-HPV18E5真核表达质粒.运用脂质体介导的方法将重组质粒转染Balb/c3T3细胞,并用含有博来霉素的培养基筛选阳性细胞株.利用Westernblot和免疫酶法鉴定HPV18E5在细胞中的表达.运用CCK-8法、流式细胞术检测HPV18E5对细胞增殖及细胞周期的影响.结果显示pSecTag-HPV18E5真核表达质粒构建成功;重组质粒转染Balb/c3T3细胞后,经400μg/mL博来霉素筛选21d,得到稳定表达HPV18 E5蛋白的细胞株;与对照组相比,HPV18 E5稳定表达细胞株的细胞增殖能力明显增强,细胞周期中S期的比值明显增加.研究表明HPV18 E5对细胞增殖及细胞周期有影响.本结果为进一步深入研究HPV18 E5蛋白的生物学特性及致癌作用奠定了基础.
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人乳头瘤病毒16型 E5蛋白的生物学活性研究进展
宫颈癌发病率位于女性肿瘤的第3位，全球每年有约27万女性死于宫颈癌［1］。人乳头瘤病毒（ human papilloma virus， HPV）持续感染是宫颈癌的主要危险因素，90％以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。 HPV是一种乳头瘤空泡病毒，为球形DNA病毒，能引起皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出130多种HPV，根据其致癌危险性不同可分为低危型（ low-risk human papilloma virus ， LR-HPV ）和高危型（ high-risk human papilloma virus ， HR-HPV ）两大类。其中， HR-HPV除可引起生殖器疣病外，更重要的是还可引起外生殖器癌、高度宫颈上皮内瘤变（ cervical intraepithelial neoplasia， CIN）和子宫颈癌［2］，较常见的是 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35等，而又以HPV16普遍，部分地区宫颈癌组织中HPV16检出率可高达77．6％～82．6％。 HPV16感染宫颈上皮基底层细胞后病毒基因组复制，并以游离体形式引发宫颈上皮内瘤变，然后以结合体形式整合到宫颈上皮细胞基因组中，进而使原癌基因过度表达、抑癌基因失活，终导致宫颈细胞癌变。 HPV16基因可编码9个开放阅读框架，根据其功能不同可分为：早期区（ E）、晚期区（ L）和非编码区（ NCR），其中早期区（ E）共编码E1-E7共7个蛋白，它们共同参与病毒复制、转录、翻译及细胞转化等［3］。对E6和E7蛋白的致癌作用已有较深入的研究，它们分别与p53和Rb蛋白结合使其降解，导致细胞周期失调、无限增殖而呈永生化，终形成肿瘤［4］。然而对E5蛋白的致癌作用研究相对较少。本文将结合近研究对E5蛋白的生物学活性进行综述如下。
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人乳头瘤病毒16型E5基因克隆、原核表达及产物鉴定
目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.
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人乳头瘤病毒16型E5蛋白功能的研究进展
人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白具有特殊的生物学活性,在宫颈癌发生过程中起重要作用.HPV16 E5蛋白具有转化活性,并可增强E6和E7蛋白的致癌活性.E5蛋白的转化活性主要通过上皮生长因子受体(EGFR)信号上调发挥作用.近年来还发现,HPV16 E5蛋白是影响免疫系统和炎症通路的关键因子,可能成为宫颈癌治疗的一个靶标.本文就HPV16 E5蛋白当前的研究进展进行综述.
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人乳头瘤病毒16型E5蛋白在宫颈癌中表达及其作用的研究进展
宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤,其发生发展与HPV的感染密切相关.HPV16是宫颈癌患者中感染率高的亚型,其编码的早期蛋白E5、E6、E7可刺激宫颈上皮细胞转化成肿瘤细胞.E6、E7蛋白在宫颈癌晚期表达,E5可能在早期表达.E5蛋白的是否表达及其致癌机制与多种因子相关.E5蛋白可作用于细胞生长因子受体通路,下调miRNA196a,并通过与HLA I类分子结合协助感染细胞免疫逃逸,从而促进肿瘤的发生.E5蛋白与E6、E7蛋白协同会发挥更强的致宫颈癌作用.本研究对E5蛋白表达与病毒整合的关系及其对宫颈癌的作用进行了综述.
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人乳头瘤病毒E5的研究进展
人乳头瘤病毒E5是一种转化作用的癌蛋白,是细胞膜或内膜整合蛋白.人乳头瘤病毒E5在感染的细胞中表达,主要在感染细胞克隆早期的繁殖、扩张中起重要作用.它干预生长因子受体,干扰周期蛋白和周期蛋白激酶,促进病毒癌基因转化,抑制抑癌基因表达,激活启动子促进病毒繁殖,并通过多种机制促使损伤细胞,通过细胞周期,使宿主细胞增殖、分化延缓、恶性化.近年的研究揭示了不同类型人乳头瘤病毒癌蛋白的功能差异,为人乳头瘤病毒诱导细胞永生化和致癌分子机制的研究提供了依据.该文将从E5对信号转导途径的影响,对细胞周期的影响,与癌基因和抑癌基因的相互作用,反式激活作用和变异几方面综述E5的研究进展.
关键词： 人乳头瘤病毒 人乳头瘤病毒16型 E5 E5蛋白 克隆
