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一种新的干扰素基因刺激因子剪接异构体STING(sv)的结构和功能
干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)是病毒感染后机体抗病毒固有免疫反应过程中的重要蛋白分子.为了寻找STING新的剪接异构体,我们抽提了人类胚胎肾(Human embryonic kidney,HEK)293细胞RNA,用全长STING的mRNA(NM-198282.82)序列设计引物,作cDNA末端快速放大(RACE)及RT-PCR,生物信息学方法比较新序列,亚克隆STING野生型(wt)及STING剪接异构体(sv)至真核表达载体pEGFP-C1和pcDNA 3.1中.质粒EGFP-STING(wt)和EGFP-STING(sv)转染HEK 293细胞,用抗EGFP抗体作Western blot分析;质粒pcDNA-STING(wt)和pcDNA-STING(sv)转染HEK 293细胞,作荧光素酶功能分析以检测新剪接异构体对病毒诱导的干扰素β启动子荧光素酶活性的影响.我们发现了STING 3'端新的剪接异构体,与野生型相比,它缺失了第7外显子,导致阅读框架移位,相应蛋白质的C端30个氨基酸不同于野生型.Western blot出现相对分子质量(Mr)为58×103的STING(sv)蛋白强阳性条带.STING(sv)荧光素酶功能分析显示,该剪接异构体能明显抑制病毒诱导的干扰素β启动子活性.STING(sv)在多数组织和不同细胞系中都能表达.STING(sv)的发现为STING这一重要分子的功能调节提供了新的线索,它可能是病毒感染通路中干扰素的显性负性抑制剂,提示其为干扰素产生的精细调节成分,在人类病毒感染性疾病中的病理意义值得探究.
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干扰素基因刺激因子启动子的克隆、鉴定及活性分析
目的 克隆和鉴定干扰素基因刺激因子(STING)基因上游启动子序列,并评价其在人胚肾HEK-293T细胞中的启动活性.方法 以人全血DNA为模板,PCR扩增STING启动子区2154 bp序列.将此片段亚克隆至pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克隆位点,构建重组报告质粒pGL-3/STING.转染HEK-293T细胞,检测其荧光素酶活性,并利用生物信息学方法分析转录因子结合位点.结果 经酶切、测序鉴定,成功构建了含有STING启动子序列的表达质粒.与pGL-3基本质粒相比,pGL-3/STING启动子的相对荧光素酶活性增加(P＜0.01).STING启动子区域含SRY、HSF、AP1、Sp1/3、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白和GATA-1等多个转录因子结合序列.结论 STING转录起始位点上游2154 bp区域在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.
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泛素化修饰对干扰素基因刺激因子介导的固有免疫信号通路的调控
自20世纪70年代发现泛素可以调节蛋白降解过程后,科研人员针对泛素化修饰相关问题开展了一系列研究.目前已阐明泛素是一种多功能的分子标志物,它可以通过蛋白酶体依赖与非蛋白酶体依赖2种途径来调控各种细胞过程.多聚泛素链与靶蛋白之间不同的连接方式决定了靶蛋白特定的生理和病理功能.近年来研究发现,泛素化修饰在宿主抗胞内RNA或DNA病毒感染的过程中起到了至关重要的作用,而干扰素基因刺激因子(STING)是抗病毒感染中的关键分子.因此,本文主要总结了泛素化修饰对STING调控的研究进展,并讨论了在今后的研究中有待解决的一些关键问题.
