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按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达
人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难.而尖锐湿疣与HPV6感染之间是单一的因果关系,这为用疫苗预防提供了可能.实际上HPV(如16、18、6、11等型别)L1的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗正在进行Ⅱ期临床试验,前景看好[1].但是现在普遍采用昆虫细胞培养系统,价格昂贵.为降低成本,同时尝试了真核表达系统甲醇营养型酵母(Pichiapastoris)和原核表达系统大肠杆菌(E.coli)两种表达系统.按照Pichia酵母的密码偏爱性重新合成HPV6-L1基因,结果在该系统仅有少量表达[2].但是发现该合成基因在E.coli中能够高效表达,而目前文献报道的HPV L1蛋白多以融合方式(与GST)在E.coli中少量表达[3].现将工作结果报道如下,并对影响蛋白表达的可能因素作简要探讨.
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经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达
目的 利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白.方法 按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性.结果 重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10 mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55 000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白.结论 利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础.
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乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及纯化
目的 原核表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),纯化HBcAg病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),并对其理化性质进行鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏爱性对HBcAg基因进行密码子优化,全基因合成优化基因,克隆至载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-HBcAg,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达.重组蛋白经盐析和层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot、电镜观察、等电点分析、高效液相色谱(HPLC)分析和N-末端氨基酸测序等进行鉴定.结果 重组表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为21 000,为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的21.6％；纯化后其纯度可达99.4％,具有良好的反应原性,VLP形成良好,结构均一,等电点在pH6.0～6.9之间,HPLC分析形成T3和T4两种不同结构,N-未端序列正确,无氨基酸降解.结论 已成功构建了HBcAg原核表达质粒,并获得了高纯度的HBcAgVLP,为进一步研究HBcAg VLP的生物学特性奠定了基础.
