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利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Importin-α7对流感病毒生长特性的影响
流感病毒的跨种传播是一个包含病毒和宿主因子之间大量相互作用的复杂过程.除了转换细胞表面受体结合特异性,禽流感病毒还要克服核膜形成的另一个重要屏障-核输入机制来进入细胞核进行有效转录和复制.本文主要研究人源importin-α7对不同来源、不同亚型流感病毒生长的影响.根据CRISPR/Cas9靶点设计原则分别在人importin-α7功能域第5和第6个外显子设计一对小向导RNA(sgRNAs)并克隆入pX459载体,重组质粒共转染A549细胞,构建A549-importin-α7-KO细胞系;再分别用不同来源(人源、猪源和禽源)、不同亚型的甲型流感病毒与乙型流感病毒感染A549-importin-α7-KO细胞和野生型A549细胞,研究importin-α7对流感病毒生长特性的影响.经测序和Western blotting验证,成功构建A549-importin j-KO细胞系;激光共聚焦观察结果显示,importin-α7敲除后vRNPs入核减少;同时Importin-α7敲除后流感病毒的生长均受到抑制,其中importinα7对人流感病毒A/California/04/2009(H1N1)和B/Brisbane/60/2008、禽流感病毒A/Quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)、猪流感病毒A/Hunan/42443/2015(H1N1)和A/Jiangsu/1/2011(H1N1)的生长影响显著,而人流感病毒A/HongKong/4801/2014(H3N2)和禽流感病毒A/Guangzhou/333/99 (H9N2)在两种细胞中的生长差异不明显.不同流感病毒结合importin α的特异性不同,提示流感病毒可能已经进化出不同机制来利用importin-α亚型进行核输入,这对于流感病毒的宿主适应性和致病力研究具有重要意义.
关键词： CRISPR/Cas9 Importin-α 流感病毒 vRNP 入核 适应性突变 致病力 -
细胞质基质中macroH2A分子伴侣的筛选
目的 筛查细胞质基质中组蛋白H2A变体macroH2A的分子伴侣,借此研究macroH2A在分子伴侣的协助下进入细胞核的分子机制.方法 建立在羧基末端表达融合有Flag标签的macroH2A-HCD(histone core domain)(a.a.21～ 161)的HeLa S3稳定细胞系.大规模悬浮培养细胞并利用低渗处理膨胀细胞、匀浆、离心,分离得到细胞质基质.透析后,通过免疫共沉淀技术获得macroH2A-HCD蛋白复合物,利用质谱技术鉴定macroH2A-HCD蛋白复合物的成分,分析质谱数据筛选macroH2A分子伴侣.结果 通过PCR扩增macroH2A-HCD DNA片段,并将之连入感染用载体pWPXL-C1-Flag.酶切、测序鉴定正确的pWPXL-macroH2A-HCD-C1-Flag质粒经包装转染HEK293T产生的慢病毒,对HeLa S3进行感染.通过Western blot法及免疫荧光实验,证明稳定表达羧基末端融合Flag标签的macroH2A-HCD的HeLa S3细胞系构建成功.悬浮培养后收集的细胞,经过低渗溶液处理后体积膨胀为原来体积的2倍,经匀浆、离心,匀浆液自上而下依次分为4层,分别为脂膜层、细胞质基质层、细胞器层、核层,后获得纯净的细胞质基质.细胞质基质中加入Flag-M2珠子,经过免疫共沉淀实验得到蛋白复合物.经质谱分析后发现,复合物中含有macroH2A-HCD及多种已知的分子伴侣.结论 细胞质基质中的macroH2A可能在多种分子伴侣的协助下进入细胞核.
