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细胞质基质文献资料
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细胞质基质中macroH2A分子伴侣的筛选
目的 筛查细胞质基质中组蛋白H2A变体macroH2A的分子伴侣,借此研究macroH2A在分子伴侣的协助下进入细胞核的分子机制.方法 建立在羧基末端表达融合有Flag标签的macroH2A-HCD(histone core domain)(a.a.21～ 161)的HeLa S3稳定细胞系.大规模悬浮培养细胞并利用低渗处理膨胀细胞、匀浆、离心,分离得到细胞质基质.透析后,通过免疫共沉淀技术获得macroH2A-HCD蛋白复合物,利用质谱技术鉴定macroH2A-HCD蛋白复合物的成分,分析质谱数据筛选macroH2A分子伴侣.结果 通过PCR扩增macroH2A-HCD DNA片段,并将之连入感染用载体pWPXL-C1-Flag.酶切、测序鉴定正确的pWPXL-macroH2A-HCD-C1-Flag质粒经包装转染HEK293T产生的慢病毒,对HeLa S3进行感染.通过Western blot法及免疫荧光实验,证明稳定表达羧基末端融合Flag标签的macroH2A-HCD的HeLa S3细胞系构建成功.悬浮培养后收集的细胞,经过低渗溶液处理后体积膨胀为原来体积的2倍,经匀浆、离心,匀浆液自上而下依次分为4层,分别为脂膜层、细胞质基质层、细胞器层、核层,后获得纯净的细胞质基质.细胞质基质中加入Flag-M2珠子,经过免疫共沉淀实验得到蛋白复合物.经质谱分析后发现,复合物中含有macroH2A-HCD及多种已知的分子伴侣.结论 细胞质基质中的macroH2A可能在多种分子伴侣的协助下进入细胞核.
