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Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造
重组腺病毒是常用的基因转移载体,本文介绍一种对腺病毒基因组进行反向遗传改造的策略.拟在维持基因编码蛋白氨基酸序列不变的前提下,突变去除重组人5型腺病毒Ad5GFP基因组的PmeI酶切位点.软件分析腺病毒质粒pAd5GFP序列,选择限制性内切酶BamHI将pAd5GFP切割为大小11.7和24.6kb两个片段,24.6kb大片段自身环化形成一个质粒pAd5GB,PmeI位于其上.PmeI/AscI双酶切pAd5GB质粒,产生2.4kb和22.2kb两个片段;在引物部位引入突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaaT),PCR扩增得到两端各延长30bp的上述2.4kb片段,与22.2kb片段进行Gibson组装,转化E.coli TOP10感受态细胞,得到pAd5GBXP质粒.BamHI酶切pAd5GBXP,碱性磷酸酶处理,与11.7kb片段连接,还原得到腺病毒质粒pAd5GXP.PacI线性化pAd5GXP质粒,转染293细胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析证明Ad5GXP基因组不含有PmeI位点.研究结果说明将酶切连接与DNA组装技术相结合,能够方便灵活地对腺病毒基因组进行突变改造.
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MEP代谢通路组合优化提高β-胡萝卜素产量
通过简单可靠的方法提升目标产物产量是代谢工程的一大目的,但代谢流量的不均衡利用与酶活性不足往往会限制生物合成的效率.目前已有许多关于单个酶的优化研究,本研究展示了一种可以平衡代谢流量的新型组合优化方法,该方法基于Gibson组装(GA)与双顺反子设计(BCD)标准起始元件.以MEP通路为例,通过选取2个限速酶编码基因:dxs和idi,与5个绝缘BCD起始元件,在有限步骤内产生了一个组合优化库,再以β-胡萝卜素为指示物进行筛选,使产量提升至10倍以上.研究结果证实了该组合优化方法的有效性与代谢通路优化工程的巨大潜力,同时提示这种优化方法适用于一系列次级代谢通路.
