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反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测
利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)对中国主要的丙型肝炎病毒(HCV) 1b和2a基因型进行扩增.首先,收集临床采样标本,对其进行定量和定性.第二,分别根据HCV 1b和HCV 2a序列的5’非转录区(5'UTR)设计相应的RT-LAMP引物.第三,利用与非特异模板的交叉反应以评价各引物的特异性,利用内切酶酶切产物以进一步保证扩增准确.第四,利用倍比稀释的模板以评价各引物的灵敏性,并用依赖钙黄绿素/Mn2+的可视化方法与电泳结果比较.后,利用RT-LAMP对所有采样标本进行HCV 1b和HCV 2a两组平行反应,SPSS统计学软件对其实用性初步评价.结果显示,所设计的RT-LAMP引物特异性好,HCV 1b和HCV 2a型产物大小均与预期相同.低可检测的模板量为100 IU/mL,且可视化染色方法电泳结果相一致.统计学软件比较扩增结果表明RT-LAMP与实时荧光定量PCR之间没有统计学差异(P＞0.05).综上,RT-LAMP设备简单,操作简便,具有在基层医疗机构的应用前景.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) 中国 1b基因型 2a基因型 反转录环介导等温扩增 -
丙型肝炎病毒JFH1NS5A基因对HC-J4病毒复制和感染性的影响
目的 探讨丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)2a FL-J6JFH NS5A基因置换对1b型HC-J4复制和感染性的影响,为建立HCV 1b细胞模型奠定基础.方法 将JFH1 NS5A置换至HC-J4基因组内,构建嵌合全长基因组HC-J4/JFHNS5A.体外制备野生型HC-J4、嵌合体及FL-J6JFH的RNA转录体,脂质体介导转染Huh-7.5细胞,采用间接免疫荧光法(IFA)检测转染细胞内的蛋白表达,HCV负链RNA特异性RT-PCR法和荧光定量PCR方法(FQ-PCR)检测基因复制情况.转染后不同时间收集转染细胞上清,感染naive Huh-7.5细胞,观察其感染性.结果 IFA未观察到野生型HC-J4和嵌合体转染细胞内HCV蛋白的表达,但在转染后18 d内的各个时间点,均检测到HCV负链RNA,表明嵌合体和野生型HC-J4在转染细胞内呈低水平复制.转染后第9天和12天,FQ-PCR检测表明,嵌合体转染细胞内HCV RNA水平明显高于野生型转染的细胞(P<0.05).不同时间点转染细胞上清感染naive Huh-7.5细胞后.IFA均未观察到表达HCV蛋白的阳性细胞.结论 JFH1 NS5A蛋白虽然在一定程度上可提高1b型HC-J4株在体外培养细胞中的复制能力,但还不足以产生能够检测到的感染性病毒颗粒.HCV 1b细胞模型的建立尚受其他因素的影响.
