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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究
目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.
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脉冲电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外心肌样细胞分化的研究
观察脉冲电磁场(PEMFs)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)在体外向心肌样细胞分化的影响.选用第3代rBMSCs用于实验.实验分为PEMFs诱导组、5-氮胞苷(5-Aza)诱导组和对照组:PEMFs诱导组给予rBM-SCs 50 Hz、1 mT低频脉冲电磁场刺激,30 min/d,分别刺激10 d、15d和20 d;5-Aza诱导组给予rBMSCs 10μmol/L 5-Aza诱导1d,对照组不予处理；后两组与PEMFs诱导组同步培养10、15和20 d.通过倒置相差显微镜逐日连续观察细胞的生长状况和形态特征,采用实时荧光定量PCR检测肌钙蛋白T(TNNT2) mRNA和α-辅肌动蛋白(ACTN2) mRNA表达量的变化.结果显示:对照组rBMSCs呈纺锤形、多角形或梭形,随时间延长,细胞形态无明显变化；5-Aza或PEMFs诱导后,细胞形状逐渐变长,大量细胞聚集生长,且随着诱导时间的延长,聚集趋势不断增加,刺激20 d,细胞聚集呈长链状,高倍镜下可见细胞伸长明显,且部分细胞与邻近细胞融合.与对照组相比,5-Aza 诱导组TNNT2mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的19.40倍(P＜0.01)、21.02倍(P＜0.01)和2.38倍;ACTN2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的6.64倍(P＜0.01)、6.67倍(P＜0.01)和0.76倍.PEMFs诱导组中TNNT2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的15.78倍、6.73倍和2.73倍(均有P＜0.05)；ACTN2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的4.93倍(P＜0.01)、1.89倍和0.64倍.而与5-Aza诱导组比较,PEMFs诱导组中TNNT2mRNA在3个时间点的表达量分别为相应5-Aza诱导组的0.81倍、0.32倍(P＜0.01)和1.15倍；ACTN2mRNA在3个时间点的表达量分别为相应5-Aza诱导组的0.74倍、0.28倍(P＜0.01)和0.83倍.本研究结果表明,在我们所选用的PEMFs条件下,PEMFs可以诱导rBMSCs在体外向心肌样细胞分化,佳作用时间可能为第10 d.
关键词： 脉冲电磁场 大鼠骨髓间充质干细胞 5-氮胞苷 肌钙蛋白T α-辅肌动蛋白 -
兔骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌细胞的实验研究
目的 体外诱导兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs )向心肌细胞分化,进一步证实其多向分化特性.方法 分离、培养兔的MSCs,将第5代的MSCs在体外经5-氮胞苷诱导4周后,进行免疫组化鉴定和电镜观察.结果 5-氮胞苷诱导MSCs 4周,部分细胞表达肌钙蛋白T(troponin T),电镜观察到肌丝形成.结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,在体外经5-氮胞苷诱导可转化为心肌细胞.
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5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化
目的:研究5-氮胞苷(5-Aza)对培养人骨髓间充质干细胞(MSC)的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定.方法:采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞(MB-MNC),用含200 ml/L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养.采用差速贴壁法纯化MSC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原.以-Aza诱导第3代MSC 24 b后继续培养.培养4周,用免疫细胞化学染色法榆测肌系标记抗原:α-肌动蛋白(α-actin)及心肌细胞特异性标记抗原:肌钙蛋白T(cTnT);在透射电镜下观察细胞的超微结构.结果:MSC经5-Aza诱导分化后,可表达α-actin和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSC中均未见表达.透射电镜可观察到肌丝等心肌细胞的特异性结构.结论:5-Aza可诱导MSC分化为心肌样细胞.
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5-氮胞苷诱导单层P19细胞向心肌分化
目的:研究Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层P19细胞向心肌分化中的作用.方法:实验分实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.两组细胞均单层培养,以5-aza(1 pxnol/L)诱导,倒置显微镜观察细胞的生长状态;5-aza诱导的4,8,12,16 d,免疫细胞化学检测横纹肌α-actin(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取5-aza诱导16 d的细胞透射电镜观察超微结构的变化.结果:实验组5-aza诱导的8,12,16 d检测到α-SA和cTnT的阳性表达,表达量逐渐增多.对照组没有两种抗体的阳性表达;实验组5-aza诱导16 d,电镜观察发现部分相邻细胞分化出细胞连接和心肌发育早期的闰盘结构,胞质中出现密集平行排列肌丝样结构.对照组没有发现分化的细胞.结论:外源表达Nkx2-5基因促进P19细胞单层生长时向心肌分化.
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5-氮胞苷诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化成肌细胞
目的:观察并检测5-氮胞苷(5-Aza)诱导大鼠脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化成肌细胞的过程中,细胞形态及相关基因、蛋白的表达情况,探讨5-Aza对大鼠AMSCs分化的诱导作用.方法:分离大鼠AMSCs,在含有10 μmol/L 5-Aza的培养液中培养,观察细胞形态的变化,并通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后MyoG的表达,免疫细胞化学染色法检测诱导后Desmin和α-Sarcometric Actin的表达.结果:用10 μmol/L 5-Aza诱导后,细胞形态逐渐伸展变长,呈现肌细胞形态;RT-PCR结果显示,诱导后15 h左右开始表达MyoG;免疫细胞化学染色结果显示,诱导10 d后Desmin染色呈弱阳性,14 d阳性程度增强,且此时部分细胞开始表达α-sarcomeric Actin,并随时间延长表达增强,至28 d呈强阳性.结论:采用10 μmol/L 5-Aza可以诱导大鼠AMSCs向肌细胞分化.
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不同浓度5-氮胞苷对骨髓间质干细胞体外诱导分化的作用
目的: 比较不同浓度药物对骨髓间质干细胞(BMMSC)体外向心肌细胞诱导分化的影响. 方法: 分离大鼠BMMSC体外培养,分别使用终浓度为1, 5, 10和20 μmol*L-1的5-氮胞苷(5-aza)对其定向诱导,观察细胞形态学变化,荧光免疫组织化学方法进行鉴定. 结果: BMMSC体外经5-aza诱导4 wk,肌钙蛋白、肌动蛋白及Connexin43表达阳性, 10 μmol*L-1 5-aza组及20 μmol*L-1 5-aza组表达较高,但20 μmol*L-1 5-aza组50%细胞死亡. 结论: BMMSC可以在体外经5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞,以10 μmol*L-1 5-aza诱导作用较好.
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5-氮胞苷对宫颈癌细胞系DAPK1异常甲基化的影响
目的观察宫颈癌细胞系SiHa及HeLa中凋亡相关蛋白激酶1(DAPK1)的表达与甲基化修饰之间的相关性,以及5-氮胞苷对细胞DAPK1表达和生长的影响.方法应用甲基化特异性PCR法分析细胞中DAPK1的甲基化状态;采用RT-PCR及免疫组化SABC法检测不同浓度5-氮胞苷干预对宫颈癌细胞DAPK1 mRNA及蛋白表达的影响;MTT法观察5-氮胞苷对细胞增殖的影响.结果 DAPK1基因在宫颈癌细胞SiHa中有甲基化修饰,5-氮胞苷干预能使其甲基化的DAPK1基因重新表达并抑制细胞生长.结论 DAPK1的甲基化修饰是宫颈癌发生重要机制之一,5-氮胞苷能使甲基化的DAPK1去除甲基化修饰,重新表达并恢复抑癌作用.
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体外定向化学诱导成人脂肪源性间充质干细胞分化为心肌样细胞
目的:研究在体外不同浓度、不同作用时间诱导条件下5-氮胞苷(5-aza)对脂肪间充质干细胞(ADMSCs)诱导分化为心肌细胞的影响.方法:酶消化筛选法体外分离ADMSCs并传代培养,流式细胞仪鉴定细胞CD44、CD34的表达,不同浓度5-aza(1、5、10、15、20 μmol/L)分别诱导12、24、48、72 h,相差显微镜下观察细胞形态变化;诱导后4周时免疫细胞化学鉴定心肌特异性肌钙蛋白I(cTn-I)的表达,分析细胞转化率.结果:体外分离培养的ADMSCs表达CD44,不表达CD34;5-aza诱导后4周时免疫细胞化学显示cTn-I表达阳性,以10 μmol/L 5-aza诱导24 h为适宜诱导条件;结论:体外5-aza化学诱导下成人脂肪组织间充质干细胞具有向心肌细胞分化的潜能.
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5-氮胞苷对脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响
目的:观察5-氮胞苷(5-aza)对脂肪间充质干细胞(ADMSCs)向心肌样细胞诱导分化的影响.方法:对第3代细胞以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数5%胎牛血清的完全培养基继续培养,镜下观察细胞形态学变化.RT-PCR检测NKX2.5、GATA4及cTnI基因mRNA表达,免疫组化法检测cTnI蛋白表达.结果:5-aza作用7 d后ADMSCs形态及排列开始发生变化,RT-PCR产物条带见NKX2.5、GATA4基因的表达.4周后见极个别细胞出现细微搏动,免疫细胞化学显示cTnI阳性,RT-PCR产物条带见cTnI基因表达.结论:5-aza可以诱导ADMSCs向自发搏动的心肌样细胞分化.
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砷与5-氮胞苷对人淋巴细胞DNA损伤的联合作用
为探讨砷和5-氮胞苷对人淋巴细胞DNA损伤及修复的联合作用,应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术比较研究了5-氮胞苷与砷同时和前后作用于人类淋巴细胞产生的联合毒性,结果显示10μmol/L 5-氮胞苷和10μmol/L砷单独处理人淋巴细胞2h引起明显的DNA泳动(彗星尾),但两试剂引起的DNA泳动(彗星尾)间无显著差异,5-氮胞苷前处理与砷后处理2h引起的彗星尾与其单独处理组比较非常显著,砷前处理与5-氮胞苷后处理引起的彗星尾与其单独处理组比较无显著性差异,但较对照组差异显著.10μmol/L5-氮胞苷和10μmol/L砷分别单独处理2 h引起了人淋巴细胞显著的DNA损伤(链断裂),5-氮胞苷与砷在对淋巴细胞DNA的损伤上表现为单纯相加作用.5-氮胞苷前处理显著增加了细胞对砷的基因毒性的敏感性,或砷后处理显著增加了5-氮胞苷引起的DNA损伤,5-氮胞苷后处理2 h显著抑制了细胞对砷所致DNA损伤的修复.
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5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究
目的 探讨体外5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的可行性.方法 分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代后,加入5-氮胞苷诱导24 h,按照诱导浓度分为对照组、5 μmol/L组、10 μmol/L组、15 μmol/L组4组,培养4 w,倒置显微镜观察形态变化,有无自发搏动,在第1、2、3、4 w行细胞免疫组化检测α-Actin、Connexin43表达.结果 5-氮胞苷浓度10 μmol/L组为适宜诱导浓度,5 μmol/L组浓度不能达到诱导分化作用,15 μmol/L组细胞死亡率高.未观察到心肌样细胞的单个搏动或多个同步搏动.结论 经过5-氮胞苷诱导后的心肌样细胞在形态和结构特性上均与心肌细胞相似,但由于 5-氮胞苷为细胞毒性药物,其应用于临床的安全性有待商榷.
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5-氮胞苷联合碱性成纤维生长因子诱导人胚胎干细胞定向心肌样细胞分化的实验研究
目的 探讨5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)联合碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth fac-tor,bFGF)体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)定向分化为心肌样细胞的可行性.方法 采用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层细胞体外培养hESCs,经悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EB),贴壁后分为无诱导剂组(对照组)、5-aza诱导组、bFGF诱导组、5-aza+bFGF联合诱导组4组诱导培养.诱导时间为2周.倒置相差显微镜下连续动态观察细胞形态学变化,并计算各组出现自发搏动的EB,以定量聚合酶链反应检测心肌细胞特异性基因NKX2.5、GATA4、α-actin,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT).结果 EB克隆贴壁诱导3~4 d后部分细胞出现自发性节律性搏动,以5-aza+bFGF联合诱导组为著.14 d后定量聚合酶链反应检测示5-aza+bFGF联合诱导组NKX2.5、GATA4、α-actin表达显著高于其他3组(P<0.05).免疫荧光法示5-aza+bFGF联合诱导组cTnT的表达为明显(P<0.05).结论 hESCs在体外经5-aza+bFGF联合诱导后可定向心肌细胞分化,该诱导方案为心肌再生与组织工程领域的研究奠定了基础.
