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心肌层表达tRNA源性小片段RNA
目的 研究大鼠左心室前壁(相当于心肌发生梗死的梗死区和边缘区)是否存在转移核糖核酸来源的小片段RNA(tRFs)的表达.方法 分离出大鼠左心室前壁(相当于心肌发生梗死的梗死区和边缘区)的心肌组织并提取总RNA.使用Illumina技术对小片段RNA进行测序,以获的该两个区域的50 nt以下小片段RNA的序列及表达量信息.利用Fstax和Bowtie软件,及Perl语言编程对长度为30 ～ 36 nt部分的小片段RNA进行注释,并比较两个区域tRF表达量差异.结果 大鼠心脏左心室前壁(相当于心肌发生梗死的梗死区和边缘区)的心肌组织存在tRF表达,而来源于tRNA的tRFs分别占总小片段RNA的9.15％和7.30％.且两个区域的经鉴别的28中tRFs种类及表达量十分接近.无论是相当于梗死区还是相当于边缘区的心肌组织,GlyGCC和ValCAC两个tRNA来源的tRFs占了所有tRFs的84.73％和84.66％.每一种tRNA来源的tRFs在两个区域间的表达差异小于4％.结论 生理状态下心肌组织存在tRF表达,相当于心肌发生梗死的梗死区和边缘区的心肌tRFs表达谱是十分接近的.
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小干扰RNA沉默Nanog基因对人肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响
目的:观察小干扰 RNA(siRNA)沉默 Nanog 基因对人肺腺癌 A549 细胞迁移及侵袭能力的影响. 方法:将 A549 细胞分为空白对照组(A549)、阴性对照组(siNC)及实验转染组(siNanog). 以脂质体Lipofectamine2000 将Nanog 基因特异性siRNA 转染A549 细胞;以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和West-ern blot方法检测特异性siRNA 对Nanog 基因在mRNA和蛋白水平沉默效果;以细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测干扰Nanog 基因前后A549 细胞迁移及侵袭能力的改变. 结果:RT-PCR 及 Western blot 分别显示A549-siNanog 组细胞中 Nanog 基因 mRNA 及蛋白表达(0.40 ± 0.06 及 0.50 ± 0.03)较 siNC 对照组(0.97 ± 0.03 及0.85 ± 0.02)明显下降(P < 0.05);细胞划痕及 Transwell 侵袭实验分别显示 A549-siNanog 组细胞迁移能力及侵袭能力[(57 ± 0.04)%及 69.60 ± 17.14]较 siNC 对照组[(95 ± 0.02)%及 209.60 ± 15.40]明显降低(P < 0.05). 结论:Nanog-siRNA 能有效抑制A549细胞Nanog 基因表达,降低人肺腺癌A549 细胞迁移及侵袭能力,Nanog-siRNA 可有效调控A549细胞恶性生物学行为.
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人端粒酶逆转录酶基因小片段干扰RNA慢病毒表达载体的构建及其在子宫颈癌caski细胞的表达
目的 构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)慢病毒(lentivirus,LV)表达载体,并观察其在子宫颈癌caski细胞的表达情况.方法 以Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT基因特异性的小片段RNA(shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/H1/GFP+Pum,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA测序验证hTERT片段准确性.LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞.将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-shNC的caski细胞)和hTERT干扰组(感染携带LV3-shhTERT慢病毒的caski细胞).绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染后基因hTERT mRNA的表达情况,CCK-8法检测caski细胞增殖情况.结果 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞.荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达.hTERT干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较阴性对照组生长缓慢.结论 成功构建了携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染子宫颈癌caski细胞.该载体能够有效抑制hTERT的表达,使子宫颈癌caski细胞增殖缓慢,为进一步探讨hTERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础.
关键词： 子宫颈肿瘤 人端粒酶逆转录酶基因 慢病毒载体 小片段RNA CasKi细胞
