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LINE1-ORF1抗体的制备及神经祖细胞分化中LINE-1转座水平的检测
目的 研究转座子LINE-1在神经细胞分化中的转座水平的变化.方法 用原核表达系统表达LINE-1ORF1蛋白,免疫后制备LINE-1ORF1蛋白抗体,用Western blot法检测胚胎干细胞分化至神经祖细胞过程中LINE-1转座水平.结果 制备的抗体具有较好的特异性和灵敏度,不同类型真核细胞中LINE-1转座水平不完全一致.同时,对细胞分化过程中的LINE-1ORF1蛋白水平直接进行分析,首次在蛋白水平证实了神经细胞分化过程中LINE-1转座水平在分化前期增高,后期降低.结论 LINE-1在神经系统发育中具有较高的转座活性,提示,其在神经系统发育中扮演着重要的作用.
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PCB153对人肾上皮细胞中LINE-1表达及转座的影响
[目的]探究2,2',4,4',5,5'-六氯联苯(PCB153)对人肾上皮细胞系(293T)细胞中长散在重复序列-1(LINE-1)基因表达和转座的影响.[方法] 293T细胞每2d传代一次,传代后立即使用5μmol/L PCB153进行染毒.染毒后的细胞置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中继续培养,连续染毒10d.同时设置二甲基亚砜(DMSO)对照组.采用实时荧光定量PCR技术检测LINE-1开放阅读框1(ORF-1和开放阅读框2(ORF-2)基因的mRNA表达水平及拷贝数,LINE-1拷贝数增加反映其发生转座.Western blot检测LINE-1 ORF-1和ORF-2蛋白表达水平.[结果]与对照组比较,从第4天开始PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-1 mRNA表达水平增加(P＜0.05),从第6天开始PCB153染毒组细胞中LINE-1 ORF-2 mRNA表达水平增加(P＜0.05).染毒第10天时,与对照组(LINE-1 ORF-1:2.74±0.51;LINE-1 ORF-2:0.57±0.10)相比,PCB153染毒组的LINE-1 ORF-1蛋白表达水平(4.39±0.85)和LINE-1 ORF-2蛋白表达水平(0.78±0.10)均明显增加(P＜0.05).染毒第10天时,PCB153染毒组与对照组的LINE-1 ORF-1拷贝数分别为1.43±0.64和0.83±0.37,LINE-1 ORF-2拷贝数分别为1.11±0.52和0.81±0.12,差异均具有统计学意义(P＜0.05).[结论] PCB153暴露可增加LINE-1的表达和拷贝数,诱导其转座.
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转座介导的HIV-1整合位点分析
目的 建立转座酶反应介导的HIV-1整合位点鉴定方法,以鉴定HIV-1潜伏或复制性感染有关的整合特征.方法 采用转座酶反应介导整合序列的捕获与扩增方法,对照人基因组进行序列分析.结果 50株细胞克隆中,有45株可检测到HIV-1整合片段,共获得9个整合位点.HIV-1潜伏或复制型细胞内整合位点的分布无显著差异.HIV-1的整合位点分布于所有基因目录内,包括转录活跃基因、非编码区或重复元件,并与相邻的表观分布相关.结论 转座酶反应介导的整合位点鉴定方法简便快捷,能以大随机方式还原整合位点.HIV-1感染的整合与基因组特征存在联系.
