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RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR(Real-time PCR)检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V(Annexin V)染色并用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74％;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加.结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡.
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MEX3A在人膀胱癌组织细胞中的表达及分析
目的 探讨MEX3A基因沉默对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,并验证MEX3A蛋白在人膀胱癌组织中的表达.方法 选取8例病理诊断证实为膀胱癌患者的癌组织和癌周组织标本,其中男性5例,女性3例;年龄50～84岁,平均年龄63.4岁.实验组应用MEX3A-shRNA慢病毒颗粒转染5637膀胱癌细胞株,对照组采用阴性对照慢病毒转染.实时定量聚合酶链反应(PCR)检测MEX3A基因敲减效率,使用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,Caspase3/7法检测细胞凋亡.应用免疫组织化学染色检测膀胱癌及癌周组织细胞中MEX3A蛋白表达量.结果 实时荧光定量PCR检测经shRNA慢病毒感染两组目的基因mRNA水平的表达丰度,实验组为(0.26±0.05),对照组为(1.00±0.05);两组比较,MEX3A基因在实验组5637膀胱癌细胞中的mRNA水平的表达量受到抑制(t=17.7,P<0.05).实验组与对照组相比,细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),细胞凋亡显著增加(P<0.05).在400倍光学显微镜下观察,棕黄色颗粒为人MEX3A蛋白与兔MEX3A抗体反应后染色所致,表示有MEX3A蛋白表达;在癌组织中较多,着色较深,癌周组织中较少,着色较浅.MEX3A蛋白在癌及癌周组织总的表达量分别为(7.33±2.73)分、(4.42±1.98)分,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);癌组织中的表达量约是癌周组织中的1.66倍.结论 MEX3A基因可以促进膀胱癌细胞增殖,并抑制其凋亡;MEX3A蛋白在膀胱癌组织中呈现高表达.
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慢病毒介导的靶向干扰MEX3A基因膀胱癌稳定细胞株的建立
目的 构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,建立稳定干扰MEX3A基因表达的膀胱癌细胞株.方法 采用实时PCR检测膀胱癌细胞株中MEX3A基因的表达;应用GV115质粒构建重组靶向MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,鉴定及测序合格后,与包装载体共转染293T细胞产生慢病毒颗粒,病毒滴度测定后转染膀胱癌细胞,经抗生素筛选建立稳定表达siRNA的细胞株,实时PCR检测敲减效率.结果 MEX3A基因在膀胱癌5637和T24细胞中均有表达,且5637的表达量高于T24;鉴定及测序结果显示成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体,包装后病毒滴度较高,实时PCR结果表明慢病毒转染5637细胞后能稳定抑制MEX3A基因的表达.结论 应用慢病毒介导的RNA干扰技术可成功建立稳定抑制MEX3A基因表达的细胞株.
