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磷酸化组蛋白H3——检测心肌细胞有丝分裂指数的可靠指标
目的 采用磷酸化组蛋白H3鉴定心肌细胞有丝分裂,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础.方法对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞进行培养,利用免疫荧光双重染色技术,用横纹肌肌动蛋白IgM单克隆抗体标记心肌细胞,用磷酸化组蛋白H3 IgG单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest 33342显示细胞核.荧光显微镜观察并摄片. 结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色.结论 磷酸化组蛋白H3是观察和鉴别心肌细胞有丝分裂的可靠指标.
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NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达
目的:构建核呼吸因子-1(NRF-1)基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1)后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2 (2-1).方法:利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6.3-NRF1-IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度.用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2(2-1),然后用杀稻瘟素(blasticidin)筛选转染阳性细胞.用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量.结果:收集的重组慢病毒滴度为5.5×107 TU/ml.转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光.PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组.QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2.25倍.结论:本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2(2-1)中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础.
关键词： NRF-1基因 慢病毒表达载体 H9c2(2-1)细胞 心力衰竭
