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抗冻蛋白的特性和作用机制
抗冻蛋白是非常热门的研究领域,具有广阔的应用前景.本文结合新的报道,从抗冻蛋白的多样性、热带活性和改变冰的生长,综述了抗冻蛋白的特性,阐释了抗冻蛋白的作用机制的三种假说:"偶极子-偶极子"假说、氢原子结合模型假说和刚体能量学说.
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抗冻蛋白TmAFP84的理化性质探索
目的 对抗冻蛋白TmAFP84进行理化性质分析.方法 对总蛋白质进行浓缩,用Bradford法测定TmAFP84蛋白量,并对TmAFP84蛋白的酸碱稳定性和热稳定性进行研究.结果 TmAFP84蛋白经过100℃热处理后,其低温保护效果和未经热处理的TmAFP84蛋白保护效果相比下降了约20％,但仍能使大肠杆菌在0℃的相对存活率达1.0％左右,显著高于对照水处理的大肠杆菌存活率(P＜0.05).但是100℃处理5min和10min二者间TmAFP84蛋白的保护大肠杆菌的效果差异不显著(P＞0.05).TmAFP84蛋白经过不同酸碱度pH1、pH3、pH12的缓冲液处理后,低温保护能力有不同程度下降.pH1液处理下降22％、pH3液处理下降12％、pH12液处理下降17％左右,但经pH14液处理5d后大肠杆菌抗冻保护效果下降大,其存活率几乎为零.结论 实验证明TmAFP84在较广的pH范围和较宽的温度范围内具有较强的稳定性,这为扩大生产抗冻蛋白TmAFP84及深入研究其性质和应用奠定了基础.
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几种昆虫抗冻蛋白的研究概况
昆虫抗冻蛋白具有很强的抗冻活性,其结构与其他生物不同.本文分别从结构、基因克隆、抗冻活性等方面对几种昆虫的抗冻蛋白进行综述,并对昆虫抗冻蛋白的发展前景进行了展望.
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昆虫抗冻蛋白的特性与结构
抗冻蛋白具有特殊的热滞活性,能使溶液的冰点低于熔点、抑制冰晶的生长,特别是在较低的浓度下就有抑制重结晶作用,保护生物免受冻害的影响.本文就昆虫抗冻蛋白的生化特性、影响昆虫抗冻蛋白热滞活性的因素进行介绍,以黄粉甲、云杉卷叶蛾和赤翅甲为例对昆虫抗冻蛋白的结构作了较为系统的综述.
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抗冻蛋白作为高效冷冻保护剂对易冷变性的LDH保护效果观察
目的 探讨抗冻蛋白(AFP)对易冷变性的乳酸脱氢酶(LDH)保护效果.方法 在LDH样本加入AFP、BSA、PVP设置成分别含0.001 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L AFP,0.1 mg/L、1.0 mg/L、10 mg/L BSA以及0.1 mg/L、1.0 mg/L、10 mg/L PVP为添加剂的试验样本,依次记为AFP1、AFP2、AFP3、AFP4、BSA1、BSA2、BSA3、PVP1、PVP2、PVP3组.样本中加入等量0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液作为对照.各组设5个平行管.采用程序降温仪进行冻融试验,从25℃开始以20℃/min降温速度降温至-60℃,然后进行解冻融化升温至25℃.观察5个冻融循环后各试样LDH活性改变.结果 与冻融前比较,对照组LDH活性恢复率为69.6％±4.1％,BSA1、PVP1、AFP1组LDH活性恢复率分别为75.2％±4.5％、73.3％±3.8％、71.8％±3.5％,差异有统计学意义(均P＜0.01).其他各组在冷融后酶活性恢复较好,仅出现轻度下降,差异无统计学意义(P＞0.05).添加0.01 mg/L AFP、1.0 mg/L BSA、1.0 mg/LPVP即有保护作用.结论 AFP对防止LDH冷变性有更好的保护效果.
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抗冻蛋白TmAFP84在毕赤酵母中的表达
目的 通过对黄粉甲抗冻蛋白TmAFP84进行基因克隆、表达,获得目的蛋白.方法 PCR扩增目的afp84基因,克隆到pUCm-T载体中测序并保存.通过双酶切将afp84基因定向重组到毕赤酵母表达载体pPIC9K中.醋酸锂转化法将重组质粒转化入毕赤酵母GS115,筛选出重组菌株.用0.5％甲醇诱导目的蛋白表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和海波银染鉴定目的蛋白.结果 经PCR扩增获得了目的基因片段alp84,克隆质粒pUCm-T与afp84重组获得了质粒pUCm-T-afp84.构建成功真核表达载体pPIC9K-afp84,目的抗冻蛋白TmAFP84经诱导后获得表达.结论 真核表达载体pPIC9K-afp84成功构建,并大量表达出目的抗冻蛋白,为扩大生产规模及深入研究抗冻蛋白的性质和应用奠定基础.
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昆虫抗冻蛋白及其在医学领域中的应用
抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是一类结构多样的蛋白质,具有热滞效应(thermal hysteresis,TH,降低冰点而不改变熔点)和重结晶抑制效应(recrystalization inhabition,RI).通过非共价吸附抑制机制吸附到冰核表面,限制冰晶生长和抑制冰晶重结晶,从而保护有机体免受结冰引起的伤害.由于抗冻蛋白具有阻止冰晶生长而不破坏细胞的特点,因而利用抗冻蛋白在低温中长期保存各种细胞、组织和器官,特别在器官移植中可能具有很好的应用前景.
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黄粉甲抗冻蛋白TmAFP72在毕赤酵母中的克隆、表达及理化性质
目的 通过对黄粉甲抗冻蛋白TmAFP72进行基因克隆、表达,获得目的蛋白并分析该蛋白在不同条件下的理化性质.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因afp72,克隆到pUCm-T载体中测序并保存.双酶切法将afp72基因定向重组到毕赤酵母表达载体pPIC9K中.将重组质粒转化入毕赤酵母GS115,筛选出重组菌株.用甲醇诱导目的蛋白表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染鉴定.用细菌抗冻法检测抗冻蛋白在不同酸碱条件下的活性,及经100℃不同热处理时间下的抗冻活性.结果 PCR扩增获得目的基因片段afp72,克隆质粒pUCm-T与afp72重组获得了质粒pUCm-T-afp72.成功构建了真核表达载体pPIC9 K-afp72,抗冻蛋白TmAFP72经诱导后获得表达.TmAFP72在较广的pH范围和较高的温度内均具有稳定性.结论 真核表达载体pPIC9 K-afp72成功构建,并表达出目的抗冻蛋白TmAFP72,为扩大生产规模及深入研究该抗冻蛋白的性质和应用奠定基础.
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昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备
目的: 制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清.方法: 根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi: 2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX- 4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达.表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose 4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot 进行检测.结果: SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38 000的可溶性融合蛋白.以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶ 5 000, Western blot证实BL21/pGEX- 4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合.结论: 在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础.
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黄粉甲抗冻蛋白基因克隆及生物信息学分析
目的:获得黄粉甲抗冻蛋白基因afpTx及相关生物信息学资料.方法:从黄粉甲幼虫中提取总RNA,通过RT-PCR合成黄粉甲抗冻蛋白基因afpTx的eDNA片段,克隆入载体pMDl9-T,进行测序分析.酶切后将其亚克隆入表达栽体pET32a(+),构建表达质粒pET32a-afpllx,并转化到大肠杆菌DL21后提取质粒,双酶切鉴定.采用MEGA 4.0,BioEdit 5.0.6软件对本研究克隆的抗冻蛋白基因afpTx进行氨基酸序列同源性变异及进化分析.结果:测序结果afpTx的cDNA长度为336 bp;编码112个氨基酸;酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.抗冻蛋白氨基酸序列相似性分析表明afpTx与GenBank上提交的23条黄粉甲抗冻蛋白的氨基酸序列平均一致性为88%;与11条赤翅甲抗冻蛋白氨基酸序列的平均一致性为67%,2种甲虫的平均一致性为63%.进化树分析结果显示黄粉甲与赤翅甲抗冻蛋白序列是同源序列.赤翅甲的序列趋异度显著大于黄粉甲抗冻蛋白基因序列.结论:成功克隆了本地黄粉甲的afpTx基因,该序列是GenBank上提交的黄粉甲与赤翅甲抗冻蛋白的同源序列.
