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新型肺结核三抗原组分疫苗的开发和小鼠免疫原性研究
目的 构建高效表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) ESAT6、rv3407、RpfB三个显性抗原基因(3 antigens,3Ag) 的重组人5型腺病毒(Adenovirus 5,Ad5) 载体疫苗,在小鼠模型中初步完成药效学研究.方法 用AdEasyTM XL腺病毒载体系统构建重组质粒pAd5-3Ag,经Pac I线性化后转染AD293细胞获得表达3Ag融合蛋白的Ad5-TPA-3Ag; 采用Western blot检测腺病毒载体中融合蛋白的表达; 将纯化的病毒颗粒以肌肉注射和滴鼻两种方式免疫小鼠,采用ELISA检测血清中抗体效价,对病毒的免疫剂量进行优化.结果 含3Ag基因的重组腺病毒载体构建成功.包装的病毒Ad5-TPA-3Ag以8 × 107 IFU的剂量免疫小鼠42d时各抗原的效价高,ESAT6肌肉注射和滴鼻的高效价分别为4. 54和4. 87; rv3407肌肉注射和滴鼻的高效价分别为3. 41和3. 60; RpfB肌肉注射和滴鼻的高效价为3. 63和2. 42.结论Ad5-TPA-3Ag在小鼠模型中可以诱导良好的免疫应答,可能成为一种新型的针对MTB潜伏感染的候选疫苗.
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狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及鉴定
目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)BD06株磷蛋白(phosphoprotein,P)的重组人5型腺病毒,并进行鉴定.方法 质粒pMD 18-T-BD06P经双酶切后,获得完整的P蛋白基因,将其克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA,构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-BD06P,与骨架质粒pacAd5 9.2-100经Pac Ⅰ酶切线性化后,共转染HEK293AD细胞,经同源重组,获得表达RABV P蛋白的重组人5型腺病毒rAd5-BP.采用Kaber法计算rAd5-BP滴度,RT-PCR、Western blot、直接免疫荧光方法(direct immunofluorescence assay,dFA)检测P蛋白基因在HEK-293AD细胞的转录及表达水平.以107 TCID50 rAd5-BP肌肉注射免疫昆明小鼠,14 d后,经尾静脉采血,分离血清,IFA法检测抗RABVP蛋白抗体及其反应活性.结果 经酶切及测序鉴定证明重组穿梭质粒pacAd5CMV-P构建正确;重组腺病毒rAd5-BP滴度可达108 TCID50/ml,能够介导P蛋白在HEK293AD细胞中的转录及表达,接种小鼠后可刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性.结论 成功构建了RABVBD06株P蛋白重组人5型腺病毒,该病毒能够介导P蛋白在小鼠体内有效表达,刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性,为进一步研究RABV P蛋白在病毒感染过程中的作用奠定了基础.
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化学发光法中和抗体检测技术对广州地区人5型腺病毒的流行病学研究
目的 建立高通量、可定量中和抗体检测方法,并且调查广州健康成人及儿童人群中人5型腺病毒中和抗体存在情况.方法 采用以带有分泌型碱性磷酸酶报告基因的5型重组腺病毒使用化学发光法,调查116份成人血清和94份儿童血清中5型腺病毒中和抗体情况.结果 该方法是一种适合高通量调查的血清学调查方法,广州地区成人中人5型腺病毒中和抗体阳性比例占26.72%,儿童中阳性比例为17.02%.结论 5型腺病毒在广州人群中具有一定的免疫程度,结合中和实验结果来应用该种病毒载体并同时开发其他血清型的腺病毒载体很有必要.
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hTERT启动子特异驱动IL-24重组腺病毒的包装及鉴定
目的 包装并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子特异驱动白介素-24(IL-24)的重组复制缺陷型腺病毒.方法 全基因合成优化后的hTERT启动子,插入质粒pGL3-basic的多克隆位点(pGL3-phTERT);从人外周血单核细胞扩增IL-24,插入pGL3-phTERT质粒的hTERT启动子下游获得pGL3-phTERT-IL24;随后将phTERT-IL24插入pShuttle中间质粒,使用AdEasyTM Adenoviral Vector System包装Ad-phTERT-IL24重组腺病毒;同时包装CMV启动子驱动IL-24的腺病毒载体为阴性对照(Ad-CMV-IL24),以空载腺病毒Ad作为空白对照.用20 MOI重组腺病毒感染SGC-7901、MKN-45、HF细胞,采用PCR及Western blot检测IL-24在RNA及蛋白水平的表达.结果 成功包装Ad-hTERT-IL24重组腺病毒.感染Ad-hTERT-IL24后,hTERT阳性肿瘤细胞内IL-24表达显著上调,但hTERT阴性的HF细胞则无IL-24表达;感染阴性对照Ad-CMV-IL24后,hTERT阳性或阴性细胞内均有IL-24表达,感染空白对照Ad后,hTERT阳性或阴性细胞内均无IL-24表达.结论 Ad-hTERT-IL24腺病毒载体可有效介导IL-24特异表达于hTERT阳性肿瘤细胞内.
