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尘螨变应原基因ProDer f 1突变体的制备与表达
目的 制备粉尘螨1类变应原基因ProDer f1的突变体并原核表达. 方法 PCR扩增ProDer f1基因,DNaseⅠ酶切后回收≤100 bp的基因片段.回收的基因片段进行3轮无引物PCR,并以此为模板用ProDer f1基因的特异性引物进行PCR,切胶回收与ProDer f1基因大小相当的片段,连接pUCm-T载体后测序.DNAMAN软件分析突变基因,筛选理想的突变体,连接pET-28a(+)载体后转入E.coli BL21感受态细胞进行原核表达,切胶回收表达产物并进行Western blot验证. 结果 得到ProDer f1基因的突变体C1并成功表达嵌合蛋白,SDS-PAGE电泳分析该蛋白分子质量单位为35 ku,与预期值相符；Western blot显示该嵌合蛋白能与粉尘螨变应原致敏兔血清中特异性抗体结合. 结论 成功制备ProDer f1基因的突变体且能在原核表达系统中表达嵌合蛋白.
关键词： 粉尘螨1类变应原基因 基因改组 突变体 原核表达 哮喘 -
尘螨1类变应原基因的DNA改组及生物信息学分析
目的 构建尘螨1类变应原ProDer f 1和ProDer p 1基因的改组文库,并筛选出编码优势T细胞表位和低B细胞表位的嵌合基因.方法 PCR扩增ProDer f 1和ProDer p 1基因,等量(V/V)混合PCR产物,DNaseⅠ酶切200 s,回收50～150 bp的基因片段,进行3轮无引物PCR,以此为模板分别用ProDer f 1和ProDer p 1基因的特异性引物进行有引物PCR,切胶回收与ProDer f 1和ProDer p 1基因大小相当的基因,连接pUCm-T载体,并转化E.coli DH-5α,涂LB板(Amp+)37 ℃过夜培养,随机挑取单克隆菌落进行PCR验证,100个阳性克隆测序并进行序列比对及T细胞和B细胞表位预测.结果 ProDer f 1特异性引物扩增并筛选出10个改组明显的重组基因,生物信息学分析显示:与野生型变应原相比,6个重组子的T细胞表位增加,B细胞表位减少;而ProDer p 1特异性引物扩增的基因未发生明显交换.结论 应用DNA shuffling技术成功构建尘螨变应原ProDer f 1基因的嵌合文库,并筛选出了编码优势T细胞表位、低B细胞表位的嵌合基因.
