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TLR2在实验脑型疟中的作用研究
目的 探讨Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)在伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA,PbANKA)诱导的实验脑型疟(experimental cerebral malaria,ECM)中的作用.方法 取PbANKA采用蚊叮感染、子孢子定量感染和红内期原虫感染3种方式感染TLR2-/-C57BL/6小鼠,同时以WT C57BL/6小鼠为对照.蚊叮感染时,先以PbANKA疟原虫感染斯氏按蚊,然后斯氏按蚊通过叮咬实验小鼠使其感染疟原虫.子孢子定量感染时,先以PbANKA疟原虫感染斯氏按蚊,然后通过解剖按蚊唾液腺获得疟原虫子孢子,定量注射感染实验小鼠.红内期原虫感染时,先以PbANKA疟原虫感染WT C57BL/6小鼠获取感染疟原虫红细胞(parasitized? Red? Blood? Cell,pRBC),然后用pRBC定量感染实验小鼠.通过观测实验小鼠红细胞原虫率、存活率及ECM发生率,判定TLR2是否参与ECM的发生.结果 蚊叮感染时,TLR2-/-C57BL/6小鼠与WT C57BL/6小鼠原虫率在ECM发生期间(6～9 d)无显著差别,表明TLR2缺失对PbANKA疟原虫在小鼠体内的增殖无显著影响.两组小鼠在感染6d后均开始出现偏瘫、昏迷等典型CM症状,9d内全部发生ECM并死亡,ECM发生率均为100％,小鼠存活率均为0.子孢子定量感染时,两组实验小鼠红细胞原虫率无显著差异;小鼠存活率TLR2-/-组为0,WT组为10％;ECM发生率TLR2-/-组为100％,WT组为90％,均无显著差异.红内期原虫感染时,两组实验小鼠红细胞原虫率无显著差异,感染后8d全部发生ECM并死亡,ECM发生率均为100％,小鼠存活率均为0.结论 3种感染实验中小鼠TLR2缺失均未影响ECM的进程,表明ECM的发生不依赖于TLR2的参与.
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活体成像技术在实验脑型疟中的应用研究
目的 构建表达Luciferase的伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA),感染昆明小鼠并于实验脑型疟发生时对小鼠进行活体成像,建立实验脑型疟活体成像平台,为脑型疟发病机理及疟疾疫苗和药物评价研究奠定基础.方法 大量制备重组质粒p10027并酶切使其线性化.复苏冻存原虫并于体外培养富集成熟裂殖体.收集成熟裂殖体与线性化的质粒混匀后进行电转化,对构建的虫株进行药物筛选;提取疟原虫基因组,进行PCR鉴定.构建的伯氏疟原虫ANKA-Luciferase疟原虫采用常规方法感染昆明小鼠,当小鼠于感染6d后出现偏瘫、昏迷及视网膜病变等典型脑型疟症状时,采用活体成像技术观察疟原虫增殖及分布情况;解剖分离感染小鼠各脏器组织并成像,观察疟原虫在各器官组织粘附情况.结果 PCR检测两端插入序列及Luciferase序列均能获得预期片段,提示重组质粒成功整合入伯氏疟原虫ANKA基因组内.活体成像观察感染小鼠在小鼠脑型疟发生时体内原虫水平较高,且随血流呈全身性分布;器官成像观察原虫在小鼠各重要脏器均有粘附,特别是脑部聚集了大量的感染疟原虫的红细胞.结论 成功构建了伯氏疟原虫ANKA-Luciferase疟原虫,并利用此原虫感染小鼠建立了实验脑型疟活体成像平台.
关键词： 伯氏疟原虫ANKA株 荧光素酶 实验脑型疟 活体成像 -
实验脑型疟的发生不依赖Toll样受体4
目的 探讨Toll样受体4(TLR4)是否参与实验脑型疟的发生.方法 采用伯氏疟原虫ANKA株(P.b ANKA),以三种方式感染TLR4-/- C57BL/6小鼠和对照WT C57BL/6小鼠,分别为:模拟自然感染的按蚊叮咬、子孢子定量感染以及红内期疟原虫感染.按蚊叮咬感染和子孢子定量感染:复苏液氮冻存P.b ANKA原虫一管,腹腔注射2只C57BL/6小鼠,待小鼠原虫率增殖至5%~10%时取全血传至6只C57BL/6小鼠,供3~5日龄斯氏按蚊血餐,按蚊血餐19d后,捆绑TLR4-/- C57BL/6小鼠和WT C57BL/6小鼠供按蚊叮咬感染,或者抓取感染性按蚊解剖出蚊唾液腺获得子孢子,然后定量感染实验小鼠;红内期原虫感染:液氮复苏P.b ANKA原虫,腹腔接种2只C57BL/6小鼠, 3~4 d后取106感染疟原虫红细胞腹腔接种感染实验小鼠.结果 三种感染方式下,在原虫率上,TLR4-/-C57BL/6小鼠和WT C57BL/6小鼠原虫生长曲线接近,说明TLR4缺失后不影响P.b ANKA原虫在小鼠体内的增殖;在实验脑型疟发生率和存活率上,TLR4-/- C57BL/6小鼠和WT C57BL/6小鼠均在5~10d内全部发生脑型疟并死亡,脑型疟发生率均为100%,存活率均为0%.两组实验小鼠在原虫增殖、脑型疟发生率及存活率上均无差别.结论 TLR4不参与实验脑型疟的发生发展.
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不同种鼠对实验脑型疟发生的影响研究
目的 比较昆明小鼠和C57BL/6小鼠作为种鼠对实验脑型疟模型的影响.方法 分别以伯氏疟原虫ANKA株感染C57BL/6小鼠和昆明小鼠作为传代用种鼠,当种鼠原虫率为5％～15％时接种子代C57BL/6小鼠,观察两组小鼠原虫率、脑型疟发生率以及死亡率.同时,通过脑组织切片和脑部淋巴细胞的流式检测,观察两组发生脑型疟小鼠的脑部微血管中感染疟原虫红细胞和CD8+T细胞的粘附情况,另外,通过感染CD8+T KO小鼠,证实CD8+T细胞在两组小鼠发生脑型疟中的作用.结果 用昆明小鼠作为种鼠的实验组的原虫率和脑型疟发生率均明显高于用C57BL/6小鼠作为种鼠的实验组,发生脑型疟小鼠的脑部组织切片发现,脑部微血管可见明显的感染疟原虫红细胞的粘附和CD8+T淋巴细胞浸润；而用昆明小鼠作为种鼠感染CD8+T细胞缺失的C57BL/6小鼠并不能诱导实验脑型疟的发生.结论 与C57BL/6小鼠相比,昆明小鼠作为种鼠的实验组的脑型疟发病率更高,而且感染疟原虫红细胞和CD8+T细胞在脑部微血管内的粘附也是该脑型疟发生的主要因素,因此,更适合用于实验脑型疟模型的建立及其机制的探讨.
