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医学媒介生物微量组织直接扩增DNA条形码序列方法的研究
目的 为保证DNA条形码序列模板DNA来源的单一性,和大程度减少凭证标本的形态破坏,建立一种从医学媒介生物微量组织中免提取,直接扩增DNA条形码序列的方法.方法 以螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块为材料,通过优化裂解液浓度、裂解液和缓冲液配比,优化反应体系和反应条件,用KOD FX DNA聚合酶进行DNA条形码序列的直接扩增,反应产物测序,与NCBI基因库中的序列进行比较以验证其是否被污染.结果 裂解液优化为NaOH 50 mmol/L;裂解液和缓冲液配比优化为9∶1;反应体积优化为每50μl反应体系中2×KOD FX DNA聚合酶buffer(含Mg2+)25 μl、2 mmol/L dNTP 10 μl、KOD FX DNA聚合酶(1 U/μl)lμl、正向引物LCO1490(20 μmol/L)、反向引物HCO2198(20 μmol/L)各1μl;反应条件优化为:95℃3 min;98℃10s,50℃30 s,68℃1 min,35个循环;68℃7 min.测序结果显示无污染,均为有效序列.结论 该方法操作简单而且省去了DNA提取的步骤,节约了时间和费用,适合螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块DNA条形码序列的直接扩增.
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HBV DNA免提取核酸荧光定量PCR检测法应用评价
目的 评价乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法(一步法)对不同病毒载量时检测性能.方法 评价试制为圣湘公司HBV DNA荧光定量PCR检测免提取试剂盒,对照试剂为匹基公司、科发公司、达安公司3家煮沸核酸提取法试剂盒.将4种试剂盒按各自要求对配套的不同浓度标准品、阴性、临界值的反应曲线考核其线性和灵敏度.另检测1份已知浓度质控品、5份未知浓度样本血清考核其准确性、可比较性.检测仪器为瑞士罗氏公司Light Cycler荧光定量仪.结果 一步法、匹基公司、科发公司、达安公司4家标准品浓度相关性R2分别为0.992、0.998、0.999及0.963,线性均满意.4个不同浓度标准品扩增曲线图形:一步法曲线比其他3家更为光滑,呈间距均匀的S形抛物线,2次结果重复曲线更趋重迭.对已知定值为(15E+06)IU/mL的质控品检测:一步法、匹基公司、科发公司、达安公司相应结果为(1.16E+06)、(527E+05)、(432E+05)及(490E+06)IU/mL,一步法接近靶值.5份血清结果显示:4种试剂盒除P公司对2号样本结果为低于检出下限外,其他对1号、2号、3号、5号检出结果均与其他3家接近,可为临床接受.4号样本为一个低值临界范围,出现低于报告限、低值及临界追踪值3种结果现象.结论 4家HBV DNA荧光定量PCR检测检测试剂线性结果均满意,对中、高浓度样本检测结果较接近,但在低浓度临界范围检测报告可能会对临床诊断带来误导,需追踪复查.HBV PCR一步法检测技术免除了核酸高温裂解提取步骤,操作简便,人为误差减少,性能稳定,有利提高检测灵敏度、结果准确性.
