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慢病毒介导shRNA干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖作用的研究
目的:探讨干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制.方法:设计4对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒pLVshRNA-EGFP (2A) Pu-ro中去,构建sh/ADAM10-1,sh/ADAM10-2,sh/ADAM 10-3,sh/ADAM10-4和sh/Con;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MM.1S细胞,流式细胞术分选GFP+细胞.利用实时定量PCR及Westem blot检测慢病毒载体介导的shRNA干扰ADAM10基因的作用.选取ADAM10下调显著的细胞株,CCK-8法检测干扰ADAM10后细胞的增殖,Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测促凋亡基因BAD、BAK、BIK抑凋亡基因BCL-2、c-Myc以及Notch1及其下游靶基因Hes-1的转录变化.结果:成功构建了特异性干扰ADAM10表达的慢病毒载体,干扰ADAM10基因对MM.1S细胞的增殖具有抑制作用,并能诱导MM.1S细胞的凋亡,且促凋亡基因BAD、BAK表达升高,抑凋亡基因BCL-2、c-Myc表达降低.Q-PCR结果显示,干扰ADAM10后Notch1水平升高,Hes-1水平降低.结论:干扰ADAM10基因可显著抑制MM.1S细胞的增殖,促进其凋亡,其机制与Notch1信号通路有关.
关键词： ADAM10基因 Notchl信号通路 慢病毒载体 多发性骨髓瘤 MM.1S细胞 -
RNAi技术沉默星形胶质细胞Adam10基因模型的建立
目的:建立离体星形胶质细胞Adam10基因沉默模型.方法:体外培养SD大鼠乳鼠星形胶质细胞,采用免疫荧光方法标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以鉴定星形胶质细胞及其纯度.通过RNA干扰(RNAi)技术,使用转染试剂Lipofectamine2000将靶向作用于大鼠Adam10基因的siRNA序列转染至星形胶质细胞内,通过Real time-PCR和Western blotting技术在RNA水平和蛋白水平检测沉默效率.结果:靶向作用于星形胶质细胞Adam10基因的siRNA序列成功转染入星形胶质细胞,并且转染Adam10基因靶向干扰序列的星形胶质细胞Adam10基因的表达在RNA水平和蛋白水平较阴性对照组明显降低(P＜0.05).结论:可以通过RNAi技术建立离体星形胶质细胞Adam10基因沉默模型.
