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环 AMP 依赖性蛋白激酶类文献资料
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以蛋白激酶A为靶点的抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用
目的建立以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核药物高通量筛选模型，应用该模型筛选具有特异性酶活抑制活性的微生物发酵液粗提物样品。
方法以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板，扩增目的基因片段 pknA，构建表达载体 pET43.1a-pknA，在大肠杆菌中克隆表达了重组 MTB PknA 蛋白；采用三步级联的反应方法，利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸到氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸这一反应大吸光值波长的变化，建立和优化蛋白激酶 A 抑制剂高通量药物筛选模型。
结果成功构建了表达载体 pET43.1a-pknA；建立了稳定灵敏，可用于靶向结核分枝杆菌蛋白激酶 A 的抗结核药物高通量筛选模型；利用该模型对4000个微生物发酵液粗提物样品进行筛选，终得到21个抑制蛋白激酶 A 活性的阳性样品，阳性率0.53%；以耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌为检定菌，平板纸片法检测阳性样品的抗分枝杆菌活性，然后对阳性样品的细胞毒性和酶活抑制特异性进行评价后，终得到8个阳性样品，其中 I10AA-02916、I09AA-02717、I09AB-02729、I08AB-00801这4个阳性样品酶活抑制特异性、抗菌活性均较好，且细胞毒性较低。
结论建立了高稳定性的以蛋白激酶 A 为靶点的抗结核药物高通量筛选模型，应用该模型所得到的发酵液阳性样品值得进一步研究。关键词： 环 AMP 依赖性蛋白激酶类 药物评价 临床前 抗结核药 高通量筛选
