您当前的位置：
首页 > 文献资料
所属专业：
LR 克隆酶文献资料
-
位点特异整合型微环DNA的构建及应用
目的联合应用 LR 克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统，建立一种获得位点特异整合型微环 DNA 的方法，为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。
方法应用分子克隆技术，在目的基因表达盒及链霉菌attB 位点两端接入λattR 和λattL 片段，随后插入ΦC31整合酶基因表达盒，构建可获得微环 DNA 的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL 和λattR 序列可在 LR 克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及 attB 位点的微环 DNA。以限制性内切酶酶切、定性以及定量 PCR 分析其重组效率。并将未经纯化的 LR重组体系转染 HeLa 细胞，以流式细胞技术、克隆计数、ELISA 等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平，并与传统质粒进行比较。
结果 LR 克隆酶可有效催化亲本质粒的重组，重组率达80%以上。重组体系中的微环 DNA 和微质粒无需纯化即可成功转染 HeLa 细胞，且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒。
结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA 的方法。
