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位点特异整合型微环DNA的构建及应用
目的联合应用 LR 克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统，建立一种获得位点特异整合型微环 DNA 的方法，为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。
方法应用分子克隆技术，在目的基因表达盒及链霉菌attB 位点两端接入λattR 和λattL 片段，随后插入ΦC31整合酶基因表达盒，构建可获得微环 DNA 的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL 和λattR 序列可在 LR 克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及 attB 位点的微环 DNA。以限制性内切酶酶切、定性以及定量 PCR 分析其重组效率。并将未经纯化的 LR重组体系转染 HeLa 细胞，以流式细胞技术、克隆计数、ELISA 等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平，并与传统质粒进行比较。
结果 LR 克隆酶可有效催化亲本质粒的重组，重组率达80%以上。重组体系中的微环 DNA 和微质粒无需纯化即可成功转染 HeLa 细胞，且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒。
结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA 的方法。 -
高压尾静脉注射和位点特异性整合介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠
目的 通过高压尾静脉注射将携带attB和人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)的质粒与表达phiC31的质粒共同导入血友病B小鼠肝脏细胞,检测目的 质粒能否整合入小鼠基因组并持续表达.方法 ①构建表达hFⅨ并携带attB核心序列的真核表达载体attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP,并在体外验证该载体能否表达目的 基因.②用高压尾静脉注射法将该载体与表达phiC31的质粒CMV-int共注入血友病B小鼠,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP单独注射为对照.③ELISA的方法检测hFⅨ在其体内的表达;用出血时间评价血友病小鼠出血症状是否改善;用巢式PCR检测attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP是否整合到基因组的整合热点mpsL1(mouse pseudo-site from liver 1)位点.结果 经鉴定,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP载体构建成功,并在体外表达hFⅨ.高压尾静脉注入血友病B小鼠24 h后,hFⅨ血清水平达到高值为(1533±239)ng/ml,此时小鼠的出血症状明显改善.但是不论是否与CMV-int共注射,此后hFⅨ水平迅速下降,在注射后10 d内降到本底水平.巢式PCR的结果证实,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP整合到小鼠肝脏基因组的mpsL1位点.结论 phiC31可以将34 bp的attB短序列整合到小鼠基因组的整合热点mpsL1;由CMV启动hFⅨ的能够瞬间高表达并有效改善血友病小鼠的出血症状;但是外来DNA进入细胞后,无论是否整合到基因组均被迅速沉默,说明肺脏和肝脏对整合入基因组的CMV启动子表达调控的机制不尽相同,因此对用于基因治疗的裸DNA进行改进使其适合在靶器官表达是十分必要的.
