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丁型肝炎病毒核酶反式切割HBV mRNA片段的实验研究
目的探讨反式作用丁型肝炎病毒(HDV)核酶体外切割乙型肝炎病毒(HBV) mRNA片段的可行性.方法将化学合成的核酶cDNA克隆到含有T7启动子的载体PGEM-4Z中.利用体外转录技术转录出核酶及底物,研究其体外切割活性.利用E-H作图法进行核酶的酶促动力学研究.结果在体外实验中显示两酶均能成功的将底物切割,37℃温浴90 min的切割百分率为50%和51%.利用E-H作图法进行的酶促动力学研究中求得Rc1、Rc2的Km值分别为0.61 μmol/L、0.58 μmol/L,Kcat值分别为:0.64*min-1、0.60*min-1.结论反式作用HDV核酶对非HDV底物-HBV mRNA片段的成功切割为寻找新的HBV的反义抑制手段开辟了途径.
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丁型肝炎病毒抗原的原核表达及抗原性分析
目的利用含T7启动子和His纯化标签pRSET B质粒构建丁型肝炎病毒抗原(HDAg)重组表达质粒(pRSETB-HDAg),转化宿主菌,表达并纯化,获得生物活性高抗原性强的基因工程重组抗原.方法将中国河南株HDAg基因片段插入pRSET B表达质粒,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导表达.表达产物经Chelating亲和层析纯化后,采用EIA方法分析HDAg的抗原性.结果重组HDAg稀释1000倍(10 ng/ml)仍与抗体有较强的反应.经与美国HDAg和华美公司生产的HDV诊断试剂同时检测26份HDV阳性参比血清,三者结果比较,除美国抗原漏检1份,检出率为96.15%(25/26份)外,病毒CDC和华美试剂均无漏检,检出率为100%,三者检测结果具有很高的符合率.结论成功构建了丁型肝炎病毒抗原重组表达质粒(pRSETB-HDAg),在原核细胞获得稳定高效表达,EIA 检测证明HDAg抗原性好,可用于组装HDV诊断试剂,用于临床丁型肝炎患者的诊断和我国丁型肝炎病毒感染流行病学的调查.
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丁型肝炎病毒基因组RNA包埋锤头状核酶的活性研究
目的探讨用丁型肝炎病毒(HDV)基因组来包埋HBV靶向性核酶对核酶体内外活性产生的影响.方法用和HBV靶基因体外转录产物在不同反应条件下温育对HDV-核酶重组体的体外切割活性定量分析;与HBV基因组共转染Huh-7细胞以考察核酶在细胞内对HBV基因表达水平的抑制.结果体外实验发现,温度及核酶和底物的二级结构对包埋于HDV序列的核酶体外切割活性均有较大的影响.提高反应温度或消除二级结构都可使HDV包埋核酶的体外活性达到明显效果,与相同条件的裸露核酶活性没有太大差异.而细胞实验则表明,活性明显优于裸露核酶,可以将靶基因的表达抑制到极低水平.结论HDV RNA序列对所包埋核酶体外活性有一定的抑制作用,在细胞内则使核酶的活性得到显著增强.
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丁型肝炎病毒内蒙古株的原核表达及抗原性分析
目的 获得表达量高、抗原性强的基因工程重组抗原.检测不同地区的丁肝患者血清,初步验证其抗原性及在检测不同地区丁肝血清方面的差异.方法 从内蒙古某丁肝患者血清中提取丁肝病毒,经RT-PCR与PCR,使用PET43a表达质粒及HDV L-Ag 5'和3'端引入His标签获得丁型肝炎病毒L-Ag 重组表达质粒,转化BL21(Rosetta)宿主菌,IPTG诱导表达.表达产物经饱和硫酸胺沉淀与亲和层析柱纯化后,采用EIA竞争法分析其抗原性.结果 经与ABBOTT Murex anti-Delta(total)试剂盒同步检测15份阳性和10份阴性血清,一致率100%.结论 EIA检测,证明具有良好的抗原性,基因工程表达的抗原蛋白在检测不同地区丁肝血清方面未见差异,故可用于丁肝的诊断及相关研究.
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广东省佛山市乙型肝炎患者伴随丁型肝炎感染的现状调查
目的 了解广东省佛山市的丁型肝炎(丁肝)感染现状,为全国的丁肝流行病学调查工作奠定基础.方法 搜集广东省佛山市第一人民医院2011年的乙型肝炎(乙肝)阳性血清,以不同公司的丁肝酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)诊断试剂平行检测;进一步以反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法辅证.结果 两种ELISA丁肝诊断试剂检测结果一致,8例阳性;经RT-PCR进一步验证,结果正确.结论 广东省佛山市丁肝病毒感染率高于全国平均水平,无性别统计学差异,且感染人群偏于高年龄组.
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乙型肝炎病毒感染者血清中丁型肝炎病毒标志物检测分析
目的 了解丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus,HDV)感染标志物在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者中的分布状况并分析其临床意义.方法 收集HBV感染者的临床资料和血清样本,通过酶联免疫分析法检测其血清HBV感染五项指标、HDVAg和Anti-HDV,结合临床诊断和生化指标进行分析.结果 收集HBV感染者样本462例,其中无症状携带者210例,慢性肝炎175例,急性乙肝35例,肝纤维化42例,检出HDV感染率为4.8％,男性显著高于女性,肝纤维化组的HDV感染率高,为9.5％,其次为慢性肝炎的6.9％,45～60岁人群的HDV感染率为7.8％,显著高于其他年龄段.结论 慢性乙肝和肝纤维化病例的HDV感染显著增高,提示HDV感染与肝病的严重程度相关,建议对肝病患者开展血清HDV感染标志物检查,鉴别是否存在HDV重叠感染.
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乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究
目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证.方法利用Primer Premier 5.0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定.用PixSys 5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片.样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析.结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因.杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳.结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性.
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云南省部分人群HDV感染状况的研究
近年国内研究表明,内地人群广泛存在(Hepatitis delta virus, HDV)感染.为进一步了解云南自然人群及肝炎病人中HDV的感染状况,本研究对云南部分自然人群和肝炎病人进行了调查,结果如下.
