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应用外部引导序列切割人巨细胞病毒UL148 RNA的研究
目的 研究人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)临床病毒株UL/b'区域UL148基因功能及抗HCMV治疗新策略,应用DNA性质外部引导序列(External guide sequences,EGS)在体外抑制UL148 RNA的表达.方法 应用RNA structure生物软件模拟UL148 RNA二级结构,选择二级结构相对简单的区域设计EGS,并合成EGS核苷酸序列.应用PCR方法分别扩增UL148及M1RNA基因,克隆至T7启动子下游,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录UL148 RNA及M1RNA,其中UL148以32p标记并进行体外转录.混合EGS、M1RNA及UL148 RNA于切割反应液中,反应1h后,进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,Typhoon扫描仪观察结果.结果 根据UL148 RNA二级结构选取第58 ～72位碱基作为EGS结合区域,其切割位点位于57位,针对此区域设计EGS57,并在体外进行EGS57与UL148 RNA结合的二级结构的模拟,可形成M1RNA天然作用底物类似的茎环结构.在T7 RNA聚合酶的作用下,分别在体外转录M1RNA及UL148 RNA,其大小均与预期相符.经切割反应,可获得与预期切割位点相符的切割条带.结论 EGS57可切割UL148RNA,其切割位点准确,与预期相符.该研究为进一步探讨UL148基因功能提供有效基因沉默工具.
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人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因的体外表达及功能位点预测
目的 体外获得人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)临床病毒株 UL148 RNA及探讨其基因功能.方法 将感染HCMV的新生儿尿液接种人胚肺细胞,分离HCMV临床病毒株,并经多重PCR鉴定.扩增UL148基因,经双酶切后克隆入pGEM-T-Easy质粒,构建重组质粒,并置于T7启动子下游,经重组质粒、PCR产物、双酶切产物电泳鉴定及序列测定.克隆成功的质粒以32P标记,进行体外转录RNA.根据UL148序列特征应用生物信息学分析其翻译后修饰位点.结果 成功在体外获得HCMV临床病毒株,经电泳及序列测定证实重组质粒构建成功,在T7 RNA聚合酶作用下,体外获得UL148 RNA.翻译后修饰位点显示UL148基因存在1个与细胞黏附相关的特征序列,1个豆荚外源凝集素β-链标记位点、2个N-豆蔻酰化位点,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点,7个蛋白激酶C磷酸化位点,1个cAMP/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点和2个N-糖基化位点,1个跨膜区域.结论 UL148基因编码产物可能为一个病毒黏附分子,参与宿主细胞的信号转导作用.
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人巨细胞病毒临床病毒株UL148基因B细胞表位的预测与分析
目的 预测与分析人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株UL148基因B细胞表位.方法 应用生物信息学方法,以HCMV UL148基因氨基酸序列为基础,采用改进型自我优化预测结构(SOPMA),Garnier-Osguthorpe-Robson (GOR),人工神经网络预测法(HNN)预测二级结构,结合跨膜结构、Hopp＆Woods亲水性方案、Emini可及性方案、Jameson-Wolf抗原性方案等参数综合预测UL148基因B细胞表位.结果 HCMV pUL148氨基酸包含316个氨基酸残基,相对分子质量为36 kD,等电点为9.15;应用SOPMA,GOR,HNN方案预测pUL148二级结构,均显示以α-螺旋为主,无规则卷及β-转角区域多位于14～21,98～106,132～139,174～181,191～197,267～272,235～240.TMHMM预测pUL148存在一个跨膜区域,为286～308位氨基酸,胞外区域为1～285位氨基酸.结论 HCMV UL148基因265～275,221～229,18～25位氨基酸序列区域内或其附近主要以无规则卷或β-转角结构为主,且抗原指数(AI)较高,极有可能是B细胞表位.
