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cGAS促进HTLV-1反转中间体ssDNA90诱导的固有免疫应答
目的 探讨DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(Cgas)在成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)的反转中间体诱导的固有免疫信号通路中的调控功能.方法 将HTLV-1的反转中间体ssDNA90转染入HeLa细胞,采用免疫印迹试验检测Cgas在HeLa细胞中的表达变化;将Cgas表达质粒,转染入HeLa细胞,24 h后再转染入ssDNA90,real-time PCR试验检测HeLa细胞中干扰素(IFN)-β、干扰素诱导蛋白10(IP-10)、调节活化正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达,免疫印迹试验检测HeLa细胞中干扰素调节因子3(IRF3)和p65的磷酸化水平;采用 siRNA 的方法在 HeLa 和佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导分化的 THP1 (PMA-THP1)细胞中沉默Cgas的表达,24 h后再转染入ssDNA90,real-time PCR试验检测HeLa和PMA-THP1细胞中IFN-β、IP-10、RANTES和TNF-α的表达,免疫印迹试验检测HeLa和PMA-THP1细胞中IRF3和p65的磷酸化水平.结果 ssDNA90转染后,HeLa细胞中 Cgas的表达升高;转染有Cgas表达质粒的HeLa细胞与对照组细胞相比,在ssDNA90刺激后,IFN-β、IP-10、RANTES和TNF-α的表达量增加,IRF3和p65的磷酸化水平升高;沉默Cgas表达的HeLa和PMA-THP1细胞与对照组细胞相比,在ssDNA90刺激后,IFN-β、IP-10、RANTES和TNF-α的表达量降低,IRF3和p65的磷酸化水平下降.结论 Cgas在HTLV-1的反转中间体 ssDNA90诱导的固有免疫应答中可能具有促进功能.
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cGAS通过调控固有免疫应答抑制HTLV-1在HeLa细胞中复制
目的 探讨DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)在成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染HeLa细胞过程中的功能及其作用机制.方法 将HeLa细胞与MT2细胞(HTLV-1阳性T细胞)共培养,采用免疫印迹试验检测cGAS在HeLa细胞中的表达变化;构建带有血凝素(HA)标签的cGAS表达质粒,转染入HeLa细胞24 h后与MT2细胞共培养24 h,免疫印迹试验检测HeLa细胞中HTLV-1病毒蛋白Tax和p19的表达量,real-time PCR检测HeLa细胞中HTLV-1病毒基因Tax、p19、Env、HBZ以及px转录本的量,同时免疫印迹试验检测干扰素调节因子3(IRF3)和p65的磷酸化水平,real-time PCR检测干扰素(IFN)-β、干扰素诱导蛋白10(IP-10)、调节活化正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达量.结果 与MT2细胞共培养后,HeLa细胞中cGAS的表达升高;转染有cGAS表达质粒的HeLa细胞与对照组细胞相比,在与MT2细胞共培养后,Tax和p19在蛋白水平上的表达量减少,Tax、p19、EnV、HBZ以及px转录本的量减少,IRF3和p65的磷酸化水平升高,IFN-β、IP-10、RANTES和TNF-α的表达量增加.结论 cGAS在HTLV-1感染的HeLa细胞中可能具有促进固有免疫应答并抑制HTLV-1病毒复制的功能.
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细胞自噬对HTLV-1在HeLa细胞中复制动力学的影响
目的 探讨成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染后的复制动力学及其对宿主细胞状态的影响.方法 将HTLV-1病毒阳性细胞系MT2与HeLa细胞进行共培养,获得病毒早期感染模型,免疫印迹检测病毒核心蛋白p19、凋亡相关蛋白caspase-3/9、自噬相关蛋白LC3;real-time PCR检测病毒载量;荧光素酶活性检测3′长末端重复序列(3′-LTR)转录活性;免疫荧光检测自噬体数目.结果 通过细胞共培养成功模拟了早期病毒感染;共培养后4 h、8 h、16 h、24 h、36 h,病毒核酸载量及长末端重复序列3′-LTR转录活性逐渐增加(P<0.01),24~36 h达到平台期;而核心蛋白p19的表达4 h可以检测到,但8 h后降低,16 h后又升高,24 h和36 h差异无统计学意义;病毒感染后宿主细胞中caspase-3/7/9的活性及蛋白没有明显变化(P>0.05),但是自噬相关蛋白LC3B/LC3A比例逐渐上升,伴有胞内自噬体数目的增加(P<0.01).结论 HTLV-1病毒复制动力学与宿主细胞的自噬密切相关.
关键词： 成人T淋巴细胞白血病病毒1型 复制动力学 细胞凋亡 细胞自噬 -
EGR1对HTLV-1病毒感染后宿主细胞自噬的影响
目的 探讨早期生长反应基因1(EGR1)对成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染后宿主细胞自噬的影响.方法 获得病毒早期感染模型,免疫印迹检测病毒核心蛋白p19、宿主细胞EGR1的表达;荧光素酶报告基因检测EGR1的5′端调控序列转录活性;筛选有效的EGR1 siRNA,将EGR1 siRNA转染HeLa细胞,随后HTLV-1病毒阳性细胞系MT2与HeLa细胞进行共培养,免疫印迹检测病毒核心蛋白p19、EGR1、自噬相关蛋白LC3;real-time PCR检测病毒载量;免疫荧光检测自噬体数目.结果 共培养后,宿主细胞EGR1蛋白表达和调控序列荧光素酶活性逐渐增强,且EGR1蛋白的表达与细胞自噬水平呈现正相关;筛选了有效的EGR1 siRNA,命名为siE2;共培养模型干扰EGR1的表达后,病毒核酸载量、核心蛋白p19的表达以及自噬相关蛋白LC3B/LC3A比例均下调,同时伴有胞内自噬体数目的减少(P<0.01).结论 EGR1与HTLV-1感染后宿主细胞自噬水平和病毒复制密切相关.
关键词： 早期生长反应基因1 成人T淋巴细胞白血病病毒1型 细胞自噬 病毒复制
