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  • HIV-1 CRF_BC重组亚型耐药相关新突变位点的复制动力学研究

    作者:焦洋;黄洋;李书明;李臻鹏;王彦;殷倩倩;马丽英

    目的:研究HIV-1 CRF_BC重组亚型逆转录酶(RT)区耐药相关新突变位点I132L、T139K/R对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)药物敏感性和病毒复制动力的影响。方法通过点突变的方法将HIV-1 B亚型感染性克隆PNL4-3 RT区的第132位和第139位氨基酸分别突变为亮氨酸(L)和苏氨酸(T)/精氨酸(R),与本课题组已经构建的HIV-1 CRF07_BC亚型RT区I132L和T139K/R突变感染性克隆,共同转染293T细胞系进行病毒包装并检验病毒感染性。检测突变病毒对于NNRTIs的药物[依曲韦林(TMC-125)、地拉夫定(DLV)、奈韦拉平(NVP)、依非韦伦(EFV)]敏感性,及其复制动力学特征。结果通过点突变的方法成功构建感染性克隆PNL4-3-RT-I132L、PNL4-3-RT-T139K和PNL4-3-RT-T139R。I132L和T139K/R在B亚型和CRF07_BC亚型中均能降低HIV-1对于NNRTIs的药物敏感性,体现为半数有效浓度(EC50)的升高。在CRF07_BC亚型中,I132L分别使EC50升高2.55、19.35、28.05和6.13倍;T139K分别使EC50升高4.67、3.66、7.35、3.30倍;T139R分别使EC50升高1.82、4.69、25.12和1.89倍;在B亚型中,I132L分别使EC50升高3.91、4.61、6.38和3.56倍;T139K分别使EC50升高3.13、1.78、2.26和2.10倍;T139R分别使EC50升高5.79、3.99、5.78和2.75倍。PNL4-3-RT-132L/139K/139R与野毒株PNL4-3的复制速度相近,且P24均在第11天达到峰值。但与对照株BC-WT相比,BC-RT-I132L/T139R推迟了P24到达峰值的时间,BC-RT-T139R的P24值在第14天达到峰值,BC-RT-I132L在第21天达到峰值,且峰值略低。结论 HIV-1 CRF_BC RT区新的耐药相关位点I132L和T139K/R在B亚型及CRF07_BC亚型感染性克隆上均可降低病毒对NNRTIs的药物敏感性,I132L在CRF_07BC亚型的感染性克隆上能够降低病毒的复制能力。

  • 细胞自噬对HTLV-1在HeLa细胞中复制动力学的影响

    作者:黄青松;丁自强;牛志国;王婷婷;侯小美;毛璐爽;吕若涵;李泽;黄新祥;王辉

    目的 探讨成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染后的复制动力学及其对宿主细胞状态的影响.方法 将HTLV-1病毒阳性细胞系MT2与HeLa细胞进行共培养,获得病毒早期感染模型,免疫印迹检测病毒核心蛋白p19、凋亡相关蛋白caspase-3/9、自噬相关蛋白LC3;real-time PCR检测病毒载量;荧光素酶活性检测3′长末端重复序列(3′-LTR)转录活性;免疫荧光检测自噬体数目.结果 通过细胞共培养成功模拟了早期病毒感染;共培养后4 h、8 h、16 h、24 h、36 h,病毒核酸载量及长末端重复序列3′-LTR转录活性逐渐增加(P<0.01),24~36 h达到平台期;而核心蛋白p19的表达4 h可以检测到,但8 h后降低,16 h后又升高,24 h和36 h差异无统计学意义;病毒感染后宿主细胞中caspase-3/7/9的活性及蛋白没有明显变化(P>0.05),但是自噬相关蛋白LC3B/LC3A比例逐渐上升,伴有胞内自噬体数目的增加(P<0.01).结论 HTLV-1病毒复制动力学与宿主细胞的自噬密切相关.

  • 体外无药物选择压力条件下HIV-1耐药基因突变的演变

    作者:焦丽燕;鲍作义;李韩平;郭东星;王铮;庄道民;李林;耿庆茂;刘永健;刘思扬;李敬云

    目的 分离培养体外稳定传代的原代HIV-1耐药毒株,观察失去药物压力下,耐药毒株的体外生长以及主要耐药突变的演化趋势.方法 采集15例服用拉米夫定+司他夫定+萘韦拉平(3TC+D4T+NVP)的HIV-1感染者的外周血单个核细胞(PBMC),用体外共培养的方法从中分离原代HIV-1毒株;RT-PCR扩增耐药毒株历代培养上清的HIV-1 pol区基因并测序,在Stanford HIV Drug Resistance Database数据库进行耐药性分析.结果 15例患者中病毒载量>1000拷贝/ml的有8例,均成功分离出稳定传代的原代毒株,其中2株为耐药毒株,所携带的主要耐药突变分别是K103N/K238T和M184V/K103N/Y181C/H221Y,分别对NVP和3TC/NVP高度耐药;无药物压力的体外培养过程中,M184V、K103N、Y181C和H221Y等耐药突变可以稳定传代,但是K238T发生了回复突变.结论 分离出2株稳定传代的HIV-1耐药毒株,无药物压力情况下,携带K103N突变的毒株具有较好的复制适应性,可稳定传代;携带M184V和K103N/Y181C/H221Y的毒株也能够稳定复制;本研究中发现K238T耐药突变在失去药物的条件下稳定性差,提示该位点易发生回复突变.

  • 我国 HIV-1 B'亚型感染长期存活者病毒分离及体外复制的研究

    作者:袁霖;马丽英;徐维四;孙坚萍;黄江虹;赵全壁;彭虹;邵一鸣

    目的 从 HIV-1 B' 亚型感染的长期存活者分离 HIV-1 病毒,观察 HIV-1 病毒分离与 CD4 淋巴细胞水平和病毒载量的相关性.方法 采用外周血单核细胞共培养法,从感染者外周血分离 HIV-1 毒株,测定其复制动力学,并比较 HIV 分离率与 CD4 细胞计数和病毒载量的关系.结果 从 190 例 HIV 感染者中分离到 101 株 HIV-1 病毒,平均病毒分离率为 53%;载量为<103、103~104、104~105 和>105 拷贝/ml 时,病毒分离率分别为 3.7%、36%、68% 和 73%;CD4 细胞计数为<200、200~500 和≥500 个/μl 时,病毒分离率分别为 66%、59% 和 28%.结论 HIV 病毒培养阳性率与 CD4 细胞计数呈负相关,与病毒载量呈正相关;HIV 体外复制力与病毒载量呈正相关关系.

  • 艾滋病病毒(HIV)的异质性与致病机制的关系(综述)

    作者:付春祥;孙立臣;刘燕

    HIV分为二个主要型别:HIV-1和HIV-2.早期分离的许多HIV毒株的研究表明该病毒是高度异质性的,存在具有不同生物学、血清学和分子特征的亚型.异质特征包括:细胞毒性、复制动力学、病毒产量水平、基因结构、对中和抗体的敏感性.现将HIV-1与HIV-2的相互关系的某些研究进展综述如下.

  • 牛副流感病毒3型在不同细胞中的复制动力学分析

    作者:赵红丽;刘智慧;李婷婷;黄晓娜;初佳芮;陶冬;张楠;柏丛;霍琦

    目的 对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)在Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞中的复制动力学进行分析.方法 将BPIV3分别接种至Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE)情况;采用直接免疫荧光抗体法检测3种细胞盲传3代后BPIV3的增殖情况;将病毒滴度为1.0×104 TCID50/ml的BHV3分别接种至MDBK和Vero-E6单层细胞中,培养7d,逐日测定各细胞中的病毒滴度.结果 BPIV3在MDBK细胞中盲传1代即可观察到明显的CPE;在Vero-E6细胞中盲传2、3代可见CPE;在MRC-5细胞中盲传3代未见CPE.在MDBK细胞中盲传3代可检测到较强荧光信号;在Vero-E6细胞中盲传3代荧光强度较弱;在MRC-5细胞中盲传3代未检测到荧光信号.BHV3在MDBK和Vero-E6细胞中分别于培养第5和6天时病毒滴度达峰值,分别为1.2×1010和1.0×105 TCID50/ml.结论 BPIV3在MDBK细胞中的复制动力强于Vero-E6细胞,适用于培养该病毒,MRC-5细胞不适用于培养BPIV3.

  • 乙型肝炎的免疫应答的研究进展

    作者:何梦菊

    HBV感染后的转归依赖于病毒因素和免疫系统之间的平衡。病毒因素包括初始感染剂量、病毒复制动力学和扩散能力。免疫系统因素包括:动力学、特异性、体液和细胞免疫应答的持久性,以及其它非抗原特异性效应器机制如天然免疫应答的激活和细胞因子产生。土拨鼠的研究结果提示慢性化表现在感染后出现低免疫应答的动物上,伴低水平细胞因子产生和严重程度较轻的急性肝炎(1),提示初始免疫应答的强弱是确定感染后转归的关键因素。

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