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问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究
目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.
