首页 > 文献资料
-
沙门菌细聚合菌毛作为新型载体表达外源基因片段
目的 用减毒Salmonella typhimurium ST14028-3b菌株的细聚合菌毛(thin aggregative fimbriae)构建表达HIV-1 2F5抗原表位的载体.方法 通过两步重叠PCR法(two step overlap extension PCR)构建重组体agfA::2F5,将重组体克隆至具有分离缺陷的温度敏感性低拷贝质粒pHSG415中,构成重组质粒pHSGAgfA2F5,然后经电穿孔法转化入ST14028-3b菌株中,经温度和抗生素选择压力进行等位基因置换,通过PCR筛选出含有外源基因的突变株,测序验证其序列的正确性.后,用Western blot法检测菌毛蛋白的表达,黏附试验来证明含有外源基因的菌株Bu96的黏附能力.结果 序列分析表明基因置换后的突变株在菌毛基因上含有外源基因2F5,且不含有质粒pHSG415的复制子序列.Western blot结果显示菌毛蛋白表达,黏附试验表明了菌株Bu96的黏附能力.结论 利用具有分离缺陷的温度敏感性低拷贝质粒pHSG415,在ST14028-3b的细聚合菌毛编码基因agfA上插入表达2F5或其他外源基因的方法可行.本方法的大优点在于不需要使用专门的菌株或抗生素抗性标记重组基因来进行位点特异性基因置换,同时也避免了在染色体上非目的DNA的出现.
-
以沙门氏菌菌毛为载体的重组HIV-1 447-52D表位疫苗的构建和毒力检测
目的 构建菌毛上表达HIV-1 447-52D表位的减毒Salmonella typhimurium ST14028-3b aroA-44752D,并对其毒力进行检测.方法 利用同源重组技术,将447-52D表位整合至沙门氏菌细聚合菌毛上,Western blot检测其表达情况,通过刚果红结合实验分析外源表位对菌毛吸附能力的影响.感染动物后检测重组菌的毒力及其在小鼠体内的分布.结果 重组菌的嵌合基因片段测序结果和嵌合蛋白的表达分析表明,重组菌菌毛上成功表达外源447-52D表位.重组菌携带外源表位后对刚果红吸附的能力没有改变,不影响菌毛的正常生物学活性.动物感染实验结果显示,重组菌灌胃感染BALB/c小鼠的LD50为1.45×109 CFU,与野生型减毒株相似,且重组菌可以有效地分布于感染小鼠的派氏淋巴结和脾脏中.结论 成功构建菌毛携带HIV-1 447-52D表位的减毒Salmonella typhimurium ST14028-3b aroA-44752D.菌毛携带外源表位后不影响减毒菌的毒力和并在体内分布,有望作为为口服HIV-1疫苗的候选并对其他病原体表位疫苗的研究提供了新的思路.
