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水痘-带状疱疹病毒疫苗株ORF62碱基突变及ORF62编码IE62反式激活力的分析
目的 分析水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株(vOka)ORF62碱基突变及ORF62编码即刻早期蛋白(IE62)对VZV基因启动子的反式激活力.方法 分别以vOka及其亲本株(pOka)基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF62全序列,克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建vOka和pOka ORF62表达质粒;采用双脱氧核苷酸链末端终止法对表达质粒中ORF62测序;应用基因转染瞬时表达技术比较vOka和pOka IE62在MeWo和CV1细胞中对VZV基因启动子的反式激活力差别.结果 成功构建vOka和pOka ORF62表达质粒pCAG-vOka62和pCAG-pOka62;测序结果发现,与pOka比较,vOka ORF62至少有9个碱基突变,其中106262、107136和107262位点碱基突变后分别产生Sma Ⅰ、BssH Ⅱ和Nae Ⅰ酶切位点.vOka IE62在MeWo细胞中对ORF4、ORF10和ORF61启动子的反式激活力低于pOka IE62,但在CV1细胞中对ORF9启动子的反式激活力高于poka IE62.结论 利用vOka ORF62碱基突变产生的酶切位点可鉴别vOka和pOka,vOka和poka IE62对VZV基因启动子的反式激活力差别可能与转染细胞类型有关.
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国产水痘减毒活疫苗关键基因的序列分析和比较
目的 从基因水平分析国产水痘减毒活疫苗的安全性和一致性.方法 对国内4家企业生产的水痘减毒活疫苗的关键基因(ORF38、ORF54和ORF62)进行PCR扩增和序列测定,并与Genbank公布的Dumas、P-Oka、V-Oka及国外上市疫苗Varilrix (GSK)、Varivax (Merck)的序列进行比对.结果 4家国产水痘减毒活疫苗的ORF38和ORF54区基因序列一致,并且同V-Oka、Varilrix完全一致,与Varivax (Merck)有l处差异.4家国产水痘减毒活疫苗的ORF62区基因序列基本一致,与V-Oka、Varilrix (GSK)和Varivax (Merck)均存在个别核苷酸差异.结论 4家国产水痘减毒活疫苗的ORF38、ORF54和ORF62区基因序列基本一致,稳定性较好,与V-Oka、Varilrix (GSK)和Varivax (Merck)存在较小差异,没有引入新的突变位点.
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荧光定量PCR技术用于快速检测水痘-带状疱疹病毒的研究
目的:建立特异、灵敏、高效的TaqMan荧光定量PCR方法用于水痘-带状疱疹病毒(VZV)的快速检测.方法:从GenBank下载几十株VZV基因序列进行同源性比对,选取高度保守区ORF62(编码即刻早期蛋白IE62)设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针,并对反应体系与反应条件进行优化,同时验证方法的特异性、敏感性和重复性.结果:本方法对VZV的检测具有高度特异性,与肠道病毒EV71型,柯萨奇A、B组,麻疹病毒,风疹病毒,流感病毒以及相关腺病毒B、C组等均无交叉反应；检测灵敏度达36 copies/μl；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需3h～4h.采用该方法对9份疑似VZV患者标本进行检测均为阳性,检测灵敏度明显高于病毒分离法、普通PCR法.结论:本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、高效,适用于VZV早期感染病例的快速确认以及暴发疫情的应急诊断中.
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水痘疫苗接种后突破性病例病毒分子生物学分析
水痘是由水痘-带状疱疹病毒( varicella-zoster virus,VZV)原发感染引起的一种儿童常见的、以全身疱疹并常伴有发热为特征的高度传染性疾病.接种水痘疫苗是预防水痘感染的惟一手段,1974年水痘疫苗首先在日本上市,我国于1998年开始接种.水痘减毒活疫苗是将水痘病毒Oka株(v-Oka)在MRC-5二倍体细胞培养而获得的,Oka株是当今世界广泛应用的疫苗毒种.根据美国儿科临床研究显示,疫苗的有效性为70％～90％;在预防严重的水痘中有效率为95％,其保护时间为11～20年.由于免疫的剂量与次数、疫苗的运输以及个体差异等因素,常有"突破性"水痘病例的发生.
