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鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔法基因转移体系的建立
体内电穿孔法转基因技术作为一种新型有效的转基因方法,被广泛应用于发育生物学的研究,特别是中枢神经系统发育.本研究旨在通过子宫内电穿孔法,建立鼠胚大脑皮层体内基因转移体系:将带有GFP的表达载体pCAGGS-IRES-EGFP显微注入胚胎期14.5 d的鼠胚侧脑室中,电极沿与脑中缝平行的方向夹持鼠脑,在电压30 V,脉冲时间50 ms,脉冲数5的条件下方波电击,将外源基因转移到窜管膜层细胞.胚胎被重新放回母体内,继续发育3 d.分离被转染的鼠胚脑组织,沿冠状面冰冻切片,在荧光显微镜下观察到外源蛋白GFP在鼠胚大脑皮层中的瞬时表达.鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔法基因转移体系的建立将为进一步研究皮层发育、神经元迁移、轴突导向等以及神经发生过程中相关基摹因功能奠定基础.
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一氧化氮对体外培养的胚鼠脑干5-羟色胺能神经元生长发育的影响
研究体外培养条件下一氧化氮合酶(NOS)对胚鼠脑干5-羟色胺(5-HT)能神经元生长发育的影响,进一步探讨一氧化氮在胚脑发育过程中的作用.将孕14 d SD胚鼠脑干细胞悬液接种于24孔培养板,实验分两组:即常规培养液组及NOS竞争性抑制剂L-NAME处理组.两组均在接种5、10、15、20 d后终止培养,部分盖片行NADPH-d组织化学染色,余盖片行5-HT免疫组织化学染色.观察并计数各组NOS阳性神经元和5-HT样免疫阳性神经元的形态和数量.结果显示:经L-NAME处理的胚鼠脑干细胞在培养10 d后出现NOS阳性神经元减少.虽在整个过程中未观察到5-HT样免疫阳性神经元胞体的变化,但其突起的密度及突起上膨体和生长锥的数量明显减少.以上结果表明:在生长发育的关键时期,应用NOS抑制剂会影响5-HT能神经元的形态发育和功能,提示NO参与调节神经元的发育与成熟过程.
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一氧化氮合酶和5-羟色胺在体外培养的胚鼠脑干神经元内的共存研究
采用NADPH-d组织化学和5-羟色胺免疫组织化学双重反应技术,探讨在体外培养条件下E14d SD胚鼠脑干神经元中5-羟色胺与一氧化氮合酶阳性神经元的体外生长发育过程以及5-羟色胺与一氧化氮合酶的共存.将E14 d SD胚鼠脑干细胞悬液接种于24孔培养板,实验按培养龄分4组分别在接种后5 d、10 d、1 5 d和21 d终止培养,先进行NADPH-d组织化学反应,再行5-羟色胺免疫组织化学反应.结果显示:各实验组均可观察到三种神经元,即5-羟色胺免疫阳性神经元、一氧化氮合酶阳性神经元和两者的双重阳性神经元,其中双重阳性神经元占多数,并以梭形神经元为主,胞体呈三角形、多角形、梭形或卵圆形.10 d组的双重阳性神经元突起长可达600 μm以上,末端可见明显的生长锥,轴突终末分支上分布有大量的膨体,并与其它神经元的胞体或突起之间形成接触.本研究结果证明一氧化氮合酶和5-羟色胺可以在体外培养的胚鼠脑干神经元内共存,提示一氧化氯合酶可能与5-羟色胺共同参与胚脑的发育.
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bFGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响
本研究观察了碱性成纤维生长因子对胚胎神经干细胞生长和分化的影响.从孕12 d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞,进行体外培养,分为碱性成纤维生长因子组及对照组.培养过程中观察神经干细胞的生长,于培养第3、5、10 d用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况.碱性成纤维生长因子可明显地促进培养细胞的生长和分化.免疫组化细胞计数显示,培养第3 d,特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显增加;培养第5 d,特异烯醇化酶阳性细胞数是对照组的1.9倍,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数为对照组的1.6倍,前者表达增加明显;培养第10 d,两者的阳性细胞数仍高于对照组,但增加不明显.不同培养时问的胞体长突起长度也均高于对照组;胞体直径及表面积随培养时问延长而增大.说明,碱性成纤维生长因子既能促进胚胎神经干细胞的生长,也可促使其分化为神经元及神经胶质细胞,尤以神经元为明显.
