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超声靶向破坏微泡技术在肿瘤治疗中的研究进展
目前，我国对恶性肿瘤的常规治疗方法主要有手术、放疗、化疗和生物靶向治疗等，化疗是肿瘤综合治疗中常用的手段，其效果主要取决于药物在肿瘤局部的浓度与作用时间，系统化疗时药物进入人体，聚集于肿瘤局部的药物浓度低，维持有效药物浓度时间短，而全身血液循环中药物浓度相对较高，易引起毒副作用[1]。如何在保证佳抗肿瘤效果的同时避免严重毒副作用的发生一直是临床医学上的热点和难点。
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超声介导iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的体外溶栓作用
目的 构建iRGD靶向载尿激酶脂质体-微泡复合物(iRGD-LMC),探讨其联合超声靶向微泡破坏技术(UTMD)的体外溶栓作用.方法 薄膜-水化法制备靶向微泡,冻融法制备载尿激酶(uPA)脂质体,两者通过生物素-亲和素偶联获得iRGD-LMC.共聚焦显微镜观察其形态特征,颗粒计数仪测定其粒径和浓度,BCA试剂盒测定载药量,Vevo 2100超声成像仪对其进行体外超声成像.设置不同的超声强度及时间,比较药物释放率.制作体外血栓模型,观察iRGD-LMC联合超声的溶栓效果.结果 制备的iRGD-LMC表现为普通微泡形态,浓度为(0.51±0.03)×109/ml,粒径为(2.62±0.12)μm,载药量为每108个复合物载uPA(3878.5±97.8)μg.超声下iRGD-LMC可显影并释放药物.在体外溶栓实验中,iRGD-LMC联合超声组的溶栓效率为(87.66±1.69)％,溶栓效果好,与阴性对照组 、 单纯超声组 、 单纯尿激酶组 、 单纯iRGD-LMC组比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了iRGD-LMC,并结合了脂质体高载药量 、 超声溶栓及微泡助溶的优点.体外实验证实,联合UTMD可促进药物释放,取得了显著的溶栓效果.
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超声靶向破坏微泡联合核定位信号肽增强基因转染治疗犬心肌梗死的实验研究
目的 利用超声靶向破坏微泡(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽提高人血管生成素-1(hAng-1)基因体内转染效率,治疗犬心肌梗死.方法 46只犬经股动脉明胶海绵栓塞法成功建立急性心肌梗死模型后随机分为4组,每组 10只:①空白对照(A)组;②hAng-1(B)组;③UTMD+hAng-1(C)组;④UTMD+NLS + hAng-1(D)组.模型建成后1周,经静脉注入各组治疗试剂,同时C、D组超声辐照心前区.建模前、建模后1周基因转染前及转染后28 d分别行超声检查,二维超声心动图检测各组犬射血分数及室壁运动情况,心肌声学造影检测各组犬梗死及周围区心肌血流灌注情况.转染后28 d,RT-PCR和Western Blot检测hAng-1基因相对表达量;免疫荧光SP法定位新生毛细血管,显微镜下计数新生毛细血管密度(MVD);Masson染色及心脏大体标本评价梗死区纤维化程度及面积;比较4组基因治疗效果.结果 ①建模前,4组犬室壁运动、心功能正常,心肌造影各室壁未见充盈缺损.心肌梗死建模后1周基因转染前,4组犬室壁运动幅度及射血分数均明显减低,心肌造影均显示充盈缺损,组间差异无统计学意义(P>0.05).基因转染后28 d,A、B、C、D组心功能依次增高,C、D组与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05).心肌造影D组可见较多造影剂充填,C组少许造影剂充填,A、B组造影剂充盈缺损.②RT-PCR和Western Blot显示D组hAng-1基因表达量明显高于其他组,C、D组与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05).③免疫荧光SP法结果显示A、B、C、D组MVD依次增大,C、D组与其他各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05).④Masson染色及心脏大体标本显示心肌纤维化程度及面积A~D组依次减低.结论 NLS肽能促进UTMD介导hAng-1基因在缺血心肌内的高效表达,为缺血性心脏病的基因治疗提供新方法.
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超声靶向破坏微泡介导基因传输在心血管疾病中的研究进展
随着分子生物学技术的不断发展,基因治疗在心血管疾病中的应用日益广泛,但无论是基因的直接注入还是以质粒和腺病毒作为载体均存在转染率低及安全性方面的问题.已有研究证实超声靶向破坏微泡可实现基因在心肌组织的靶向释放,提高转染率,增强治疗效果.本文就超声靶向破坏微泡介导基因传输在心血管疾病中的研究进展做一综述.
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超声靶向破坏微泡技术联合热休克蛋白72和热休克同源蛋白70双靶向小干扰RNA诱导前列腺癌细胞凋亡的研究
目的 探讨超声靶向破坏微泡技术(UTMD)联合热休克蛋白72(HSP72)和热休克同源蛋白70(HSC70)双靶向小干扰RNA(siRNA)诱导难治性前列腺癌细胞凋亡的可行性.方法 根据是否转染和应用UTMD辐照分为空白对照组(不做任何处理)、HSP72-siRNA组(转染HSP72-siRNA)、HSC70-siRNA组(转染HSC70-siRNA)、HSP72/HSC70-siRNA组(转染HSP72-siRNA和HSC70-siRNA)、UTMD+ HSP72-siRNA组(转染HSP72-siRNA,并予UTMD辐照)、UTMD+ HSC70-siRNA组(转染HSC70-siRNA,并予UTMD辐照)、UTMD+ HSP72/HSC70-siRNA组(转染HSP72-siRNA和HSC70-siRNA,并予UTMD辐照)7组.检测人前列腺癌细胞VCaP和正常前列腺上皮细胞RWPE-1中HSP72、HSC70和细胞凋亡关键执行者活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达情况.利用优化后的UTMD条件介导携带HSP72和HSC70的siRNA转染人前列腺癌细胞VCaP.转染后48 h,应用细胞计数试剂盒评价UTMD的安全性,采用Western印迹法检测细胞内HSP72、HSC70和活化型Caspase-3的表达,应用流式细胞仪检测siRNA的转染效率和肿瘤细胞的凋亡情况.结果 VCaP细胞中HSP72和HSC70均呈高表达,RWPE-1细胞中HSP72和HSC70均呈低表达或不表达;VCaP和RWPE-1细胞中活化型Caspase-3几乎均不表达.分别于转染后24、48、72、96 h检测沉默效果,结果显示,转染后48 h时,沉默HSP72基因的效果好,沉默HSC70基因的效果较好.UTMD+HSP72/HSC70-siRNA组的siRNA转染率、VCaP细胞凋亡率和活化型Caspase-3基因表达丰度均显著高于其他6组(P值均＜0.05).结论 UTMD是一种安全、无创的基因递送方法,UTMD联合HSP72和HSC70双靶向siRNA可诱导前列腺癌细胞发生凋亡,有望成为前列腺癌基因治疗的新方法.
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超声靶向转染缺氧诱导因子干扰基因治疗大鼠肝癌的研究
目的 利用超声靶向转染缺氧诱导因子干扰基因(HIF-1α shRNA),观察其对肝癌的治疗效果.方法 构建Wistar大鼠肝癌种植瘤模型.随机将大鼠分为两组:假手术组,开腹后不进行超声辐照治疗;超声靶向基因转染(UTMD)组,开腹后将基因与微泡混合后经尾静脉匀速注入,同时进行超声靶向辐照.分别于治疗后第3天、第7天、第14天行超声造影检测肿瘤大小的变化(计算公式为体积=长×宽×高×π/6),qPCR检测HIF-1α mRNA的变化,Western和免疫组化检测肿瘤细胞内HIF-1α蛋白的表达.结果 治疗前两组的肿瘤大小差异无统计学意义.治疗后第3天两组肿瘤均有一定的增大,两组肿瘤大小差异有统计学意义(P<0.05);治疗后第7天,假手术组肿瘤继续增大,UTMD组肿瘤大小保持稳定,两组间差异有统计学意义(P<0.05);治疗后第14天,假手术组肿瘤仍继续增大,UTMD组肿瘤开始缩小,两组间差异有统计学意义(P<0.05).与假手术组相比,各时间点UTMD组HIF-1α mRNA表达均明显降低,HIF-1α蛋白水平明显下调.结论 UTMD介导HIF-1α shRNA基因转染能有效干扰HIF-1α 的表达,使肿瘤组织缺氧、缺血坏死并诱发凋亡,达到抑制肿瘤生长、甚至治愈肿瘤的目的.
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核定位信号肽在超声靶向破坏微泡介导基因转染治疗犬心肌梗死中的促进作用
目的 探讨超声靶向破坏微泡(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽增强犬心肌hAng-1基因体内转染效率的可行性及应用价值.方法 构建犬急性心肌梗死模型并分组进行基因转染治疗,每组8只.A组:建模成功后未行治疗,即空白对照组;B组:建模成功后超声介导质粒DNA转染;C组:建模成功后超声介导质粒DNA加经典NLS肽转染;D组:建模成功后超声介导质粒DNA加突变NLS肽转染;E组:建模成功后超声介导质粒DNA加经典NLS肽和入核阻滞剂转染.建模后转染前,HE染色观察心肌梗死后病理变化情况.转染后3d,心肌冰冻切片检测EGFP标记的hAng-1基因表达情况,RT-PCR和Western Blot分别从基因和蛋白水平方面检测心肌组织hAng-1基因表达效率.转染后28 d,cα-SMA免疫组化定位新生毛细血管,并在显微镜下计数新生微血管密度;Masson染色及心脏大体标本评价心肌梗死区纤维化程度及面积.建模前、建模后1周基因转染前及基因转染后28 d分别应用二维超声心动图检测各组犬射血分数及室壁运动情况,比较各组基因治疗效果.结果 ①A、B、C组心肌组织中绿色荧光蛋白表达量逐渐增高,C、D、E组逐渐减少,Western Blot和RT-PCR检测结果显示hAng-1蛋白及基因表达趋势与绿色荧光蛋白一致,C组与其余各组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).(②免疫组化结果显示C组毛细血管密度高,与其余各组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);Masson染色显示A、B、C组心肌纤维化程度依次减低,C、D、E组依次增高.③建模后1周,5组犬均可见节段性室壁运动减低且射血分数明显减低,组间比较差异无统计学意义.基因转染后28 d,A、E组心功能明显减低,B、D组轻度减低,C组轻度增高,C组与其余各组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 UTMD联合NLS可高效、靶向地介导质粒DNA在缺血心肌内的表达,并促进血管新生,改善心肌纤维化,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗方面将有较好的应用前景.
