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靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定
目的构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（ phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA，shRNA）表达载体，研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用，探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段。方法根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10，经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板；合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列，将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cb-shRNA上，构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22αp-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22αe/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）；将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞，分别于转染24 h、48 h、72 h后，采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量。结果荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较，前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显，且两组均较对照组mRNA表达明显减少（ P＜0.05）；酶切鉴定重组质粒载体SM22αe/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功；质粒转染细胞后，Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22αe/p质粒组较阴性对照组均有所降低，且转染24 h后，SM22αe/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（ P＜0.05）。结论选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板，能够成功构建SM22αe/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体，且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达。
