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肽核酸压电基因传感器新型生物信号放大系统的研究
目的在构建好的肽核酸压电基因传感器检测系统上引入"RecA蛋白-互补单链DNA探针"复合体作为新型生物信号放大系统,提高传感器的检测灵敏度.方法压电基因传感器阵列表面先固定上乙肝病毒(HBV)的bis-PNA探针,加入HBV基因组DNA与之反应完全后,加入"RecA蛋白-互补单链DNA探针"与bis-PNA/dsDNA复合物反应.首先分别优化RecA蛋白及ATPγS的浓度,再观察佳条件下传感器检测系统的频率下降值和反应时间.结果当RecA 蛋白浓度为3 mg/ml,ATPγS浓度为12.5 μmol/L时,所引起的频率下降值明显.佳条件下所引起的频率改变为(112.2±12.7)Hz.结论在检测系统中加入"RecA蛋白-互补单链DNA探针"复合体,可有效地提高压电基因传感器的检测灵敏度.
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外周血K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的应用
目的 检测胰腺癌患者外周血K-rag基因第12、13密码子突变,探讨其对胰腺癌的诊断价值.方法 选取经病理证实的胰腺癌患者54例以及健康志愿者33例.抽取全部实验者外周血标本,抽提循环中的DNA,应用肽核酸钳制实时定量PCR法检测K-rag基因突变,并分析其与患者临床病理参数的相关性.结果 54名胰腺癌患者中,40例(74.1%)外周血标本可检测出K-ras基因第12或13密码子突变.33名健康志愿者外周血标本无一例检出K-ras基因突变.外周血中K-ras基因的突变与患者年龄、淋巴血管侵犯、肿瘤分化程度、肿瘤临床分期、CA19-9水平有关(P＜0.05),而与患者性别、肿瘤部位、肿瘤大小及病理类型无关.结论 肽核酸钳制实时定量PCR法检测外周血K-ras基因突变的敏感性高.外周血K-ras基因突变的检出提示肿瘤具有高侵袭性,可能预后不良.
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肽核酸钳制-PCR检测K-ras突变法的阳性判断阈值及检测下限的研究
目的 确定肽核酸钳制-PCR(PNA-PCR)检测K-ras突变的阳性判断阈值(Cut off)和检测下限.方法 将含K-ras基因12或13密码子突变的胰腺癌细胞株PANC1、SW1990基因组DNA以不同的浓度分别与K-ras野生型的胎盘DNA混合配制成含不同突变率(0、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％、3.1％、6.25％、12.5％、25％、50％)的样本,并制备1％突变率PANC1细胞及30％突变率SW1990细胞DNA总量分别为50、20、5、1 ng和50、10、5、1 ng的样本.应用PNA-PCR方法检测样本中的K-ras基因12、13密码子突变,收集它们的突变Ct值、总体Ct值,并计算出△Ct值(突变Ct值-总体Ct值).实验重复10次.采用受试者工作特征(ROC)曲线分析△Ct值,确定K-ras基因突变的适Cutoff值,计算诊断阳性率及确定诊断下限.结果 所有不同突变率的PANC1细胞12密码子突变以及SW1990细胞13密码子突变的突变Ct值及△Ct值与阴性对照样本的差异均有统计学意义(P值均＜0.05),而总体Ct值与阴性对照样本的差异无统计学意义.诊断K-ras基因12密码子突变的ROC曲线下面积(AUC)为0.926,适Cut off值为11,相应的敏感度和特异度为84％和100％,检出下限为0.4 ng;诊断K-ras基因13密码子突变的AUC为0.906,适Cut off值为9.5,相应的敏感度和特异度为71％和100％,检测下限为1.5ng.固定突变率的检测结果进一步确定上述的检测下限.结论 成功确立了PNA-PCR法检测K-ras基因12、13密码子突变的Cut off值和检测下限,达到临床应用的要求.
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阻断趋化因子受体3途径对结肠癌患者术后局部复发和肝转移影响的研究
目的 探讨趋化因子受体3(CXCR-3)对结肠癌术后局部复发和肝转移的影响.方法 常规培养HT-29细胞,采用RT-PCR、Western-blot方法检测靶向CXCR-3的反义肽核酸(asPNA)对CXCR-3mRNA和蛋白表达水平的变化.建立人结肠癌术后局部复发裸鼠动物模型、人结肠癌术后肝转移动物模型.分别经尾静脉注射asPNA、随机错配肽核酸和生理盐水,分析CXCR-3的asPNA对结肠癌术后局部复发和肝转移的抑制作用.结果 asPNA处理结肠癌细胞后,CXCR-3mRNA和蛋白表达受到明显抑制(P＜0.05).asPNA组与随机错配组和对照组比较,裸鼠结肠癌术后复发率(20%比60%、60%,P＜0.05)、肝转移率(30%比100%、100%,P＜0.05)、平均肝转移瘤数目[(7.6±2.4)比(28.4±9.8)、(26.8±8.6),P＜0.05]均显著降低.结论 CXCR-3的asPNA能够抑制结肠癌术后局部复发和肝转移,其机制可能与其特异性抑制HT-29细胞CXCR-3mRNA和蛋白表达有关.
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阻断CXC趋化因子受体3途径对同种异体胰岛移植急性排斥反应影响的实验研究
目的 研究CXC趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)反义肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对同种异体胰岛移植急性排斥反应的影响.方法 实验模型为小鼠同种异体胰岛移植模型.分为生理盐水对照组,PNA CXCR3组和随机错配PNA组.体外T细胞增殖应答能力通过淋巴细胞增殖反应来评估.应用RT-PCR和Western blot检测CXCR3 mRNA和蛋白表达水平.应用流式细胞仪测定脾CD3+T细胞CXCR3表达水平.结果 与生理盐水组[(6.72±1.48)d]和随机错配PNA组[(6.54±0.86)d]相比,PNA CXCR3组[(9.70±1.57)d]受体有功能胰岛移植物存活时间明显延长.移植后第7天,PNA CXCR3组CXCR3 mRNA水平(1.06±0.07)同生理盐水对照组(1.98±0.22)和随机PNA组(1.87±0.10)比较明显下调(P＜0.01).PNA CXCR3组移植物CXCR3蛋白水平以及小鼠淋巴细胞增殖能力与另两组比较明显降低(P＜0.01).结论 PNACXCR3通过降低T淋巴细胞活性来延长同种异体胰岛移植物存活时间,在抑制同种异体急性排斥反应中具有潜在的治疗效应.
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反义肽核酸对促甲状腺激素受体mRNA表达的影响
目的 探讨反义肽核酸(asPNA)对大鼠甲状腺细胞的细胞膜表面促甲状腺激素受体(TSHR)表达的影响.方法 设计两种与TSHR mRNA不同片段互补的asPNA,分别为核定位信号-asPNA 1(NLS-asPNA1)和NLS-asPNA2,另外合成一段非相关的干扰肽核酸(NLS-scrPNA)序列,用荧光显微镜观察NLS-asPNA能否进入细胞,采用噻唑蓝法检测asPNA对细胞是否具有毒性作用,然后用实时定量RT-PCR检测NLS-asPNA对TSHR mRNA表达的影响.结果 荧光显微镜观察发现,asPNA可以进入到细胞中去.噻唑蓝法检测发现asPNA对细胞没有毒性作用.实时定量RT-PCR结果显示,NLS-asPNA1和NLS-asPNA2可以抑制TSHR mRNA表达,表现为随着NLS-asPNA与细胞培养时间的延长,TSHR cDNA的拷贝数逐渐下降,且呈现时间依赖性,而NLS-scrPNA对TSHRmRNA的表达没有明显的影响.结论 NLS-asPNA可以进入到细胞中去,并且能够下调TSHRmRNA的表达.
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粘蛋白1介导的抗胃癌细胞MKN-45侵袭作用的研究
目的 构建粘蛋白1 (MUC1)基因的反义肽核酸(PNA),观察对胃癌细胞MKN-45侵袭能力的影响,并探讨其机制.方法 根据MUC1基因的序列设计反义PNA序列,经脂质体介导转染胃癌细胞MKN45,并设空载体组(随机对照)和空白对照组(阴性对照)运用荧光定量PCR检测MUC1的表达,并观察E-粘附素的表达变化；Transwell小室实验观察对胃癌细胞侵袭力的影响.结果 构建的3个MUC1基因的反义PNA均能有效抑制该基因表达,其表达水平分别为0.62±0.18,0.49±0.12和0.60±0.21,显著低于阴性对照组(1.18±0.03,P＜0.01).阴性对照组与随机对照组之间差异无统计学意义(1.00±0.04,P=0.657).取抑制效率高的PNA进行后续研究转染MUC1 PNA后的胃癌细胞侵袭能力显著下降(t=2.09,P=0.005),并伴有E-粘附素基因及蛋白的表达上调.结论 胃癌细胞MKN-45中MUC1基因与E-粘附素的表达存在负相关,抑制MUC1基因的表达能显著抑制肿瘤细胞的侵袭能力.
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肽核酸钳制-PCR/K-ras突变检测方法在结直肠癌组织中的诊断应用
目的 确定本实验室建立的肽核酸钳制(PNA)-PCR/K-ras突变检测方法的阳性判断标准,并评价其对结直肠癌组织的诊断价值.方法 将含K-ras基因12密码子突变的质粒和野生质粒以不同比例(突变/总体:0,1/3 200,1/1 600,1/800,1/400,1/200,1/100)混合作为标准样品,独立配制6个批次并分别进行PNA-PCR/K-ras突变检测,收集K-ras突变CT值及K-ras总体CT值,计算△CT值(突变CT值-总体CT值),采用ROC曲线分析突变CT值和△CT值诊断K-ras突变的适Cut-off值,联合两者适Cut-off值,设定该方法的终阳性判断标准.分别采用该方法和直接测序法对35例结直肠癌组织及对应癌旁组织进行K-ras突变检测并比较分析.结果 突变模板浓度为1/800及以上的标准样品突变CT值和△CT值与阴性标准品之间差异存在统计学意义(P＜0.05);突变CT值和△CT值的适Cut-off值分别为41.7和15.4.终阳性判断标准为突变CT值≤41.7或△CT值≤15.4,对应的ROC曲线下面积为0.955(P=0.001),以此判断标准,各标准样品(0,1/3 200,1/1 600,1/800,1/400,1/200,1/100)的阳性检测率分别为0％、66.7％、83.3％、100％、100％、100％、100％,检测下限为1/800.在结直肠癌及癌旁组织标本中,该方法阳性检测率为45.7％(32/70),与直接测序法(18.6％,13/70)比较差异具有统计学意义(P=0.000).结论 PNA-PCR/K-ras突变检测方法具有较高的检测灵敏度,在结直肠癌组织样本中具有较直接测序法更高的阳性检出率.
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以端粒酶为靶点的肿瘤治疗进展
端粒酶是维持端粒长度的逆转录酶,对细胞增殖、衰老及永生化和癌变起重要作用,在多数肿瘤中表达增高.以端粒酶为靶点的反义寡核苷酸、核肽酸及锤头状核酶已成为潜在的肿瘤抑制剂.现就这方面的研究进展作一综述.
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反义肽核酸下调树突状细胞CCR7基因表达抑制大鼠肝移植急性排斥反应
目的 研究反义肽核酸(PNA)下调树突状细胞(DC)趋化因子受体CCR7基因表达在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用.方法 体外培养大鼠骨髓来源的DC,设计靶向CCR7 mRNA翻译起始区的反义PNA组,以随机PNA组和空白组为对照.免疫细胞化学染色法检测反义PNA对CCR7蛋白表达的影响;趋化试验检测DC的趋化活性.建立大鼠肝移植排斥反应模型,在供肝冷保存和肝移植术后应用反义PNA,以随机PNA组和空白组为对照,观察术后受者存活时间.于术后第7、10天取移植物标本观察肝脏病理学改变;免疫组织化学染色法检测淋巴结DC数量变化以及T淋巴细胞的活化增殖情况.结果 反义PNA显著下调体外培养的DC表达CCR7蛋白,DC体外趋化活性受到明显抑制,与随机PNA组和空白组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).肝移植术后,反义PNA组与随机PNA组和空白组相比,受者腹腔淋巴结中DC;数量明显减少,T淋巴细胞活化增殖受到显著抑制,受者术后存活时间明显延长(P＜0.05).结论 通过反义PNA下调CCR7基因表达,阻断DC迁移和抗原提呈,能有效抑制急性排斥反应,延长受者存活时间.
