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血小板衍生生长因子-C对体外培养血管内皮细胞及间充质干细胞的影响
目的：观察血小板衍生生长因子?C（ PDGF-C）对体外培养的血管内皮细胞（ VECs）及间充质干细胞（MSCs）的影响。方法采用培养的大鼠主动脉内皮细胞和MSCs，应用细胞直接计数法、噻唑蓝比色法（ MTT法）评价细胞的增殖情况，流式细胞术检测细胞周期，利用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果 PDGF-C能明显刺激VECs和MSCs的增殖，增加两种细胞S期细胞的比例，对VECs增殖呈剂量依赖关系，对MSCs的促增殖作用在20μg/L达高峰。同时，PDGF-C促进VECs和MSCs的迁移能力，对MSCs迁移作用强于VECs。结论 PDGF-C可促进培养的VECs、MSCs的增殖与迁移能力。
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大鼠PDGF-C基因全长及结构域编码蛋白在大肠杆菌中的表达
目的:在大肠杆菌宿主系统中表达血小板衍生生长因子C(PDGF-C)基因全长编码的蛋白以及两个结构域编码的蛋白.方法:用PCR方法从已构建好的质粒中扩增出大鼠PDGF-C cDNA开放阅读框架片段(ORF-PDGF-C,1035bp),以及位于N端的CUB结构域(CUB-PDGF-C,333bp)和位于C端的生长因子结构域(GFD-PDGF-C,348bp),并重组入表达载体pET-24a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导PDGF-C融合蛋白的表达,经DS-PAGE,表达蛋白采用Western-blot用抗-His和抗-PDGF-C的抗体分别验证融合蛋白表达.结果:PCR扩增的PDGF-C基因序列与GenBank数据库中的序列一致;37℃,0.1 mmo·L-1IPTG诱导6h,pET-24a-ORF-PDGF-C,pET一24a-CUB-PDGF-C,pET-24a GFD-PDGF-C融合蛋白获得优化表达;Western-blot证实融合蛋白的特异性表达.结论:成功构建了pET-24a-ORF-PDGF-C,pET-24a-CUB-PDGF-C,pET-24a-GFD-PDGF-C重组质粒,并在大肠杆菌中获得有效表达,这为进一步纯化该基因表达蛋白以及研究其结构与功能奠定了基础.
关键词： 血小板衍生生长因子C 原核表达 融合蛋白 -
大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达
目的 构建含大鼠血小板衍生生长因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重组腺病毒表达载体,体外转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)并观察目的基因蛋白及mRNA表达情况.方法 通过逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)法从pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表达载体中获得PDGF-C目的片段,经BP重组与LR重组插入到pAD/CMV/V5-DEST,构建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒载体.酶切及DNA测序鉴定后转染HEK293A包装、纯化,测定病毒滴度后转染大鼠骨髓源性EPCs,应用Real-time qPCR、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测PDGF-C蛋白及mRNA的表达.结果 核酸内切酶消化及PCR分析证实PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体,转染后荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,转染48 h后实时定量酵素聚合反应技术(Real-time qPCR)测定EPCs中PDGF-C含量明显提高(P＜0.05),Wester blotting检测证实在46×103存在特异性条带.结论 成功构建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表达载体pAD-EGFP-PDGF-C,体外转染大鼠骨髓源性EPCs能高效表达目的基因产物,为后续研究PDGF-C基因功能以及进一步开展基因治疗奠定了基础.
