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微小核糖核酸miR-766通过靶向调控环腺苷酸活化交换蛋白1促进高糖培养下心肌细胞凋亡
目的 探讨微小核糖核酸miR-766在不同葡萄糖浓度培养的心肌细胞中的表达水平,明确其对心肌细胞凋亡的影响及相关分子机制.方法 在不同葡萄糖浓度条件下(正常糖5 mmol/L、高糖15、25及35 mmol/L)培养的心肌细胞中,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测miR-766的表达差异,以流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡情况,Western blot法检测各组环腺苷酸活化交换蛋白1(Epac-1)、Bax蛋白、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)活化片段蛋白表达水平.采用生物信息学预测miR-766的靶基因,并进一步采用双荧光素酶报告基因法进行验证.组间数据比较采用t检验.结果 与5 mmol/L相比,miR-766在15、25及35 mmol/L组的心肌细胞中表达上调(3.40±0.38,4.61±0.34,6.17±0.42比0.97±0.04,t=11.131～21.493,P<0.05),而转染miR-766抑制剂后,细胞的凋亡率明显降低[(16.43±0.31)％比(26.45±0.31)％,t=-39.566,P<0.05];Western blot结果表明,在人心肌细胞中miR-766高表达者Epac-1的蛋白表达减少(0.48±0.07比1.00±0.12,t=-6.695,P<0.05),而抑制miR-766的表达后Epac-1的表达增加(1.23±0.12比0.70±0.10,t=5.884,P<0.05);荧光素酶报告基因结果表明,miR-766模拟物或抑制剂与Epac-1基因3'-非翻译区野生型报告基因共转染时,报告基因荧光素酶活性明显变化(3.22±0.07比5.01±0.96,6.98±0.61比5.01±0.96,t=-3.239～-3.008,P<0.05);在高糖培养条件下抑制miR-766表达能够部分拮抗高糖对Epac-1蛋白表达的抑制作用(0.80±0.05比0.53±0.05,t=6.810,P<0.05);在miR-766模拟物处理的H9c2细胞中回补Epac-1,caspase-3活化片段蛋白的表达则明显降低(0.67±0.07比1.07±0.12,t=-5.050,P<0.05).结论 在高糖培养的心肌细胞中高表达的miR-766通过靶向调控Epac-1基因的表达,进而促进细胞的凋亡.
关键词： 糖尿病心肌病 细胞凋亡 微RNAs miR-766 环腺苷酸活化交换蛋白1
