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SEDT-PA致病基因WISP3突变体的构建及在COS-7细胞中的表达定位
目的 通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(SEDT-PA)致病型(1000 T-C,840delT)Wnt诱导分泌蛋白3(WISP 3)与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体,观察其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位,为研究WISP 3突变致SEDT-PA的机理奠定基础.方法 从正常人软骨细胞获得野生型WISP 3基因的全长cDNA(WT-WISP 3);定点突变方法构建携带WISP 3基因致病型的重组真核表达质粒MUT1000 T/C/pEGFP-C 2和MUT840 delT/pEGFP-C 2;以空白载体pEGFP-C 2为对照,脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞,48 h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达;半定量RT-PCR法检测WISP 3基因的表达.结果 测序和酶切鉴定证实插入片段大小和序列的正确;突变体在COS-7细胞中均高效表达;荧光显微镜观察发现,转染野生型WISP 3基因的COS-7细胞中绿色荧光均匀分布在细胞浆和细胞膜,转染突变体的COS-7细胞中荧光呈斑点状染色和聚集现象.结论 成功构建了SEDT-PA致病基因WISP 3突变体,且发现野生型WISP 3蛋白定位于细胞浆和细胞膜,而突变型的WISP 3蛋白在细胞浆内异常聚集,为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造条件.
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食管鳞状细胞癌组织中Cyr61、WISP3 mRNA和蛋白表达及生存分析
目的:检测人食管鳞状细胞癌组织中Cyr61、WISP3 mRNA及蛋白的表达.方法:采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学染色法对186例食管鳞状细胞癌和癌旁正常组织中Cyr61、WISP3表达水平进行测定.采用Kaplan-Meier进行单因素生存分析.结果:食管鳞状细胞癌组织中Cyr61、WISP3 mRNA和蛋白的表达较正常组织上调(P均<0.01).食管鳞状细胞癌组织中WISP3和Cyr61 mRNA的表达与淋巴结转移、浸润深度、肿瘤体积、肿瘤分期有关(P均<0.01).WISP3和Cyr61蛋白表达与吸烟、淋巴结转移、家族史、浸润深度和肿瘤分期有关(P均<0.05).单因素生存分析表明,WISP3、Cyr61 mRNA和蛋白的表达、性别、吸烟、家族史、浸润深度、肿瘤体积、肿瘤分期与患者的生存宰相关(P均<0.05).结论:Cyr61、WISP3在食管鳞状细胞癌发展过程中起重要作用;其在食管鳞状细胞癌病情进展的监测、转移潜能及预后的估计等方面具有应用价值.
