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shRNA-Piezo1对异常机械牵张应力作用下髓核细胞凋亡的影响及相关机制
目的:探讨短发夹RNA沉默压电离子蛋白1编码基因(shRNA-Piezo1)对异常机械牵张应力作用下髓核细胞凋亡的影响及相关机制.方法:取8例腰椎间突出症患者术中摘取的椎间盘组织(改良Pfirrmann分级为Ⅱ级或Ⅲ级),分别分离培养髓核细胞,取第2代髓核细胞构建体外机械牵张应力模型;利用293T细胞作为慢病毒感染靶细胞,检测适慢病毒滴度,用适滴度慢病毒感染髓核细胞;应用RT-PCR和Western-Blot法筛选出有效干扰序列,利用shRNA干扰技术构建shRNA-Piezo1干扰质粒;根据预实验处理结果,将细胞分成4组:空白对照组(取第2代髓核细胞不做机械牵张应力处理),牵张应力组(取第2代髓核细胞机械牵张应力处理24h),shRNA阴性对照组(空白载体质粒+第2代髓核细胞机械牵张应力处理24h),shRNA干扰组(shRNA-Piezo1干扰质粒+第2代髓核细胞机械牵张应力处理24h),应用Fluo3-AM试剂盒检测4组细胞的细胞质Ca2+水平;Cell Meter检测试剂盒检测4组细胞中线粒体膜电位的变化;AnnexinV-FITC试剂盒检测4组细胞的凋亡率.结果:(1)分离培养的细胞Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达阳性,符合髓核细胞特征.(2)当髓核细胞转染复数(MOI)=50时,慢病毒滴度为1×108TU/ml转染效率高.(3)homo-3201序列为shRNA-Piezo1的有效序列.(4)4组髓核细胞细胞质Ca2+含量、线粒体膜电位翻转比例和细胞凋亡率有显著性差异(P＜0.05),空白组与shRNA阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05);shRNA干扰组与牵张应力组和shRNA阴性对照组比较均显著性减少(P＜0.05),与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05).结论:shRNA-Piezo1可以抑制异常机械牵张应力作用下髓核细胞的过度凋亡,而且是通过抑制细胞质Ca2+水平和线粒体膜电位翻转来实现的.
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不同加载时间流体剪切力对成骨细胞中piezo1机械敏感型蛋白表达的影响
目的:研究加载不同时间流体剪切力(FSS)对MC3T3-E1成骨细胞piezo1机械敏感型离子蛋白表达的影响.方法:利用自行设计的平行平板FSS加载装置,对MC3T3-E1成骨细胞施加12 dyn/cm2 FSS 0、15、30、45、60、90 min,采用免疫荧光染色实验检测piezo1机械敏感型离子蛋白的表达水平.结果:piezo1明显表达于成骨细胞细胞质及细胞核,细胞质尤为明显.对体外培养的MC3T3-E1细胞加载12 dyn/cm 2 FSS,随着加载时间的延长,piezo1蛋白表达上调,在45 min左右达到高峰.结论:加载不同时间的12 dyn/cm 2 FSS能够上调MC3T3-E1成骨细胞piezo1机械敏感型离子蛋白,加载45 min合适.
关键词： 流体剪切力 MC3T3-E1细胞 Piezo1蛋白 成骨细胞 机械敏感型离子通道
