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RNA干扰对转染Livin基因的膀胱癌细胞凋亡诱导的影响
我们采用RNA干扰(RNAi)技术阻抑Livin基因表达[1],观察其对丝裂霉素(MMC)诱导细胞凋亡的影响.材料与方法选用人膀胱癌T24细胞株;siRNA由上海吉玛公司合成,正义链:5′-GGGACCACGUGGAUGGGC-AdTdT-3′,反义链:5′-UGCCCAUCCACGUGGUCCCdAdG-3′.
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抑制未成熟同源蛋白增强子基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨未成熟同源蛋白增强子(ERH)基因敲除对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响.方法 通过克隆有干扰ERH基因序列的慢病毒感染T24细胞,建立稳定的ERH基因抑制的T24细胞克隆,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测ERH mRNA的表达.通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、克隆形成法和流式细胞术检测ERH基因敲除对细胞增殖和凋亡的影响.通过裸鼠皮下成瘤实验验证体内ERH基因敲除对T24细胞成瘤效果的影响.结果 转染慢病毒后,经qPCR检测,ERH基因敲除效果满意[敲除组ERH mRNA相对表达量为0.079±0.007,未经处理的T24细胞(ERH正常组)为1.006±0.126;t=12.72,P=0.0002].MTT实验结果提示,敲除ERH基因的T24细胞增殖能力减弱[ERH敲除组490 nm波长处吸光度(A490)值为0.13±0.00,ERH正常组为0.66±0.01;t=104.61,P<0.0001].克隆形成实验结果提示其克隆能力减弱[ERH敲除组克隆数为(10.5±1.2)个,ERH正常组为(196.4±4.0)个;t=73.63,P<0.0001].流式细胞术检测结果示细胞凋亡率增加[ERH敲除组凋亡率为(11.0±0.5)％,ERH正常组为(4.2±0.5)％;t=16.06,P<0.0001].裸鼠皮下成瘤实验活体成像结果显示,ERH敲除组肿瘤区域总荧光强度为(4.67±0.59)×1010μW/cm2,ERH正常组相应部位为(9.54±4.20)×1010μW/cm2,差异有统计学意义(t=3.64,P=0.0051);ERH敲除组肿瘤重量为(0.80±0.62)g,ERH正常组为(1.79±0.71)g,差异有统计学意义(t=3.33,P=0.0037).结论ERH基因敲除可以抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,促进其凋亡.
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吡柔比星诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究
目的 探讨吡柔比星诱导膀胱癌细胞凋亡的机制.方法 采用MTT法、流式细胞术、透射电子显微镜和RT-PCR技术,研究不同浓度的吡柔比星对人膀胱癌细胞株T24的抑制作用,并检测Survivin mRNA表达的变化.结果 吡柔比星浓度为10.0和100.0 mg/L时,对T24细胞生长的抑制率分别为89.48%和90.89%,G期前出现明显的凋亡峰.吡柔比星能明显下调Survivin蛋白的表达水平,具有浓度依赖性.结论 吡柔比星诱导膀胱癌细胞凋亡是通过抑制Survivin蛋白的表达,且在一定剂量范围内具有浓度依赖性.
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转移抑制因子1在膀胱癌组织中的表达及对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察转移抑制因子1(MTSS1)在膀胱癌中组织的表达及其对膀胱癌T24细胞株增殖和凋亡的影响.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测120例膀胱癌及相应癌旁组织中MTSS1基因的表达.采用基因共转染法,将膀胱癌T24细胞设为3组:空白对照组未进行转染.实验组用PEF MTSS1质粒和PSV2neo共转染,阴性对照组用PEF和PSV2neo共转染.成功转染后,Western blot检测转染后3组细胞MTSS1蛋白的表达,噻唑蓝(MTT)法测定细胞生长抑制率,流式细胞法检测3组T24细胞的凋亡率.结果 (1)Real-time PCR结果显示:与癌旁组织比较,膀胱癌组织中MTSS1 mRNA表达明显降低,仅为癌旁组织表达量的16.36％,差异有统计学意义(P＜0.05).(2) Real-time PCR和免疫细胞组织化学证实转染后膀胱癌T24细胞中有MTSS1稳定表达.(3)MTT法结果显示:培养0、24 h时各组T24细胞数差异无统计学意义(P＞0.05),48 h后,随着培养时间延长,转染组T24细胞数明显低于空白对照组与阴性对照组(P＜0.05),而空白对照组与阴性对照组T24细胞数差异无统计学意义(P＞0.05).(4)实验组中的T24细胞株的生长抑制率明显降低,细胞增殖活力明显增加,而且凋亡率明显降低,和对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(5)形态学观察:实验组中,MTSS1作用于膀胱癌T24细胞株24h后,细胞发生明显凋亡或坏死.而两对照组仍以正常T24膀胱癌细胞为主.结论 MTSS1基因在膀胱癌中低表达,MTSS1在体外促进膀胱癌T24细胞增殖并抑制细胞凋亡.
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环氧化酶-2抑制剂Nimesulide对膀胱癌T24细胞体外生长的抑制作用
目的 观察环氧化酶-2(COX_2)抑制剂Nimesulide(NIM)对人膀胱癌T24细胞株体外生长的影响,并探讨其作用机制.方法 采用细胞形态学、MTT法、流式细胞术、吖啶橙-溴化乙啶双染法(AOEB)等技术检测NIM对体外培养的人膀胱癌细胞株T24生长的抑制效应.结果 细胞形态学观察可见NIM对T24细胞生长具有明显的细胞毒作用;MTT法、流式细胞术分析显示NIM能明显抑制T24细胞的增殖,且呈剂量、时间依赖关系;细胞周期分析表明,NIM能使T24细胞G0/G1期细胞比例升高,S期和G2/M期细胞比例下降;流式细胞DNA直方图上出现典型的亚二倍体"凋亡峰",细胞凋亡率与NIM作用时间和剂量相关;荧光显微镜检查显示NIM处理的T24细胞AOEB双染色后,细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光,典型细胞可见新月形改变,固缩或片段化的核.结论 COX-2抑制剂NIM对T24细胞生长具有明显的抑制作用,其作用机制可能与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡等有关.
