Ca2+通道抑制剂对雌激素作用下子宫内膜癌HEC-1A细胞生物学特性的影响

目的 探讨L型Ca2+通道亚型( Cav1.3)抑制剂——硝苯地平(nifedipine)和T型Ca2+通道亚型( Cav3.1)抑制剂——米贝拉地尔(mibefradil)对雌激素作用下子宫内膜癌细胞系HEC-1A细胞生物学特性的影响.方法 (1)以10μmol/L的nifedipine和mibefradil分别预处理HEC-1 A细胞15 min,然后予10 μmol/L的17β雌二醇(17β-E2)和100 μmol/L的雌二醇偶联牛血清白蛋白(E2-BSA)分别处理HEC-1A细胞0min、5min、15 min、30 min、1h、2h,采用逆转录(RT) -PCR技术检测各时间点HEC-1A细胞中Cav1.3和Cav3.1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测HEC-1A细胞中Cav1.3和Cav3.1蛋白的表达.(2)以不同浓度(均分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80、100 μmol/L)的nifedipine 和mibefradil分别处理HEC-1A细胞24、48、96h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况.(3)以10 μmol/L的nifedipine和mibefradil分别处理HEC-1A细胞0min、30 min、1h、6h、24h后,采用膜联蛋白V(annexin V)-碘化丙啶(PI)双染色法检测细胞的凋亡率.(4)以10 μmol/L的nifedipine和mibefradil处理HEC-1A细胞36 h,体外侵袭实验检测细胞的体外迁移能力(以穿膜细胞数表示).结果(1) nifedipine预处理后:①加入17β-E2:HEC-1A细胞中Cav1.3 mRNA的表达在15 min时降至低,30 min时恢复；Cav1.3蛋白在30 min时降至低,1h时升高.Cav3.1 mRNA的表达在5 min时降至低,30 min时高,以后逐渐恢复；Cav3.1蛋白的表达在各时间点无明显变化.②加入E2-BSA:HEC-1A细胞中Cav1.3 mRNA的表达在5min时降至低,15 min时恢复；Cav1.3蛋白在15 min之内逐渐增加,15 min后逐渐降低.Cav3.1 mRNA的表达各时间点均明显降低；Cav3.1蛋白在5 min时降至低,15 min后恢复.mibefrdial预处理后:①加入17β-E2:HEC-1A细胞中Cav1.3 mRNA的表达在各时间点无明显变化；Cav1.3蛋白的表达分别在15 min和1h时升高.Cav3.1 mRNA的表达在各时间点均明显下降；Cav3.1蛋白在30 min时稍升高.②加入E2-BSA:HEC-1A细胞中Cav1.3 mRNA的表达在15 min后降低；Cav1.3蛋白在15 min后明显下降.Cav3.1 mRNA的表达在各时间点均明显下降；Cav3.1蛋白在1h时下降至低.(2)以不同浓度的nifedipine和mibefradil分别处理HEC-1A细胞24、48、96h后,HEC-1A细胞增殖的抑制作用呈明显的浓度和时间依赖性(P＜0.05).(3) nifedipine处理30 min后,HEC-1A细胞的早期凋亡率较处理时间为0min时明显下降至低水平,而晚期凋亡率较处理时间为0 min时明显升高达高水平,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)；而mibefradil处理24h后,HEC-1A细胞的晚期凋亡率(为8.41±0.07)较0 min时(为3.74±0.18)增加近1倍,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).(4)nifedipine处理后HEC-1A细胞的穿膜细胞数为(94.0±8.2)个,明显少于未经处理者的(160.0±9.5)个(P=0.020)；而mibefradil处理后HEC-1A细胞的穿膜细胞数为(12.0±1.6)个,也明显少于未处理者(P=0.018).结论(1)nifedipine和mibefradil均能抑制雌激素的促进Cav1.3和Cav3.1 mRNA和蛋白表达升高的作用,且mibefradil的作用更持续.(2)nifedipine和mibefradil均能抑制HEC-1A细胞增殖、凋亡和体外迁移能力,而mibefradil较nifedipine的作用更明显.