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戊四氮致癎大鼠脑内脑红蛋白表达的初步研究
癫癎性脑损伤导致的神经元死亡包括凋亡和坏死两种形式,缺血和缺氧是引起细胞死亡的原因之一,脑红蛋白(neuroglobin,NGB)是于2000年新发现的一种神经系统特异的单体携氧球蛋白[1],对氧有很高的亲和力,并在脊椎动物神经组织特异表达,缺氧诱导的NGB表达升高具有显著的神经保护作用,而降低NGB表达后神经元中Caspase-3裂解产物表达显著增多,细胞趋于死亡[2].本文拟初步探讨NGB在戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)致癎大鼠大脑皮层组织中的表达情况.
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一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆
目的克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法运用"数据库消减杂交"(Digital Differential Display,DDD)方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学的方法克隆一个人类新基因的全长cDNA序列.结果新基因全长1197bp,开放阅读框为504～806bp,定位于6p21.1-p21.2,编码由100个氨基酸组成,分子量为10KD,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRG1(Testis Development Related Gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论"数据库消减杂交"与实验验证相结合用于发现更多人类功能新基因是行之有效的.
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利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因
目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.
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小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响
目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响, 探讨基因的生物学功能.方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Biot2, 由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞, 用Realtime RT-PCR、 Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆, 研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化.结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Biot2, 并稳定转染于NIH3T3细胞.与对照组相比, 转染了Biot2 cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快.结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节, 促进NIH3T3细胞的增殖, 为进一步研究基因生物学功能奠定了基础.
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小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2的原核表达载体的构建及表达
目的:构建小鼠睾丸特异表达基因Biot2的原核表达载体,表达pQE30-Biot2融合蛋白.方法:提取小鼠睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增Biot2基因片段,并将其克隆入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-Biot2.经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli XL-Blue,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测.结果:构建pQE30-Biot2重组原核表达质粒,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约17 700处出现了1条蛋白条带,该表达蛋白具有与His-tag单克隆抗体(mAb)特异性的结合能力.结论:成功地构建了Biot2基因的原核表达载体,并表达出pQE30-Biot2重组蛋白,为下一步制备多克隆抗体和蛋白功能的深入研究奠定了实验基础.
