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丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂诱导白血病细胞凋亡和自噬分子机制研究
目的 达努塞替(Danu)是一类主要产生激酶抑制作用的吡咯吡唑类化合物,能有效抑制在细胞有丝分裂中产生关键作用的极光激酶A和B.为了寻找新型靶向小分子药物治疗白血病,本研究探讨小分子丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂Danu对人白血病细胞的周期阻滞、自噬和凋亡的影响及相关机制.方法 采用MTT法检测Danu对人髓系白血病细胞株THP-1和红白血病细胞株K562的生长抑制作用;采用流式细胞术检测不同浓度药物处理组的细胞周期、凋亡及自噬情况;采用蛋白质印迹法检测细胞周期相关蛋白CDK1/CDC2、CDK2和Cyclin B1的表达情况,凋亡相关蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Pax、c-Caspase-3及c-Caspase-9以及自噬相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、Beclin 1、LC3I和LC3Ⅱ的水平.结果 Danu显著抑制THP-1、K562细胞的活性,其中半数抑制浓度(IC50)值分别为26.89和32.51 μmol/L;Danu可以诱导THP-1、K562细胞周期阻滞,其中THP-1细胞中Danu浓度梯度处理组细胞后G2/M期百分率与对照组细胞(9.9％)相比增加至(31.3±2.1)％、(35.6±2.7)％、(39.1±1.5)％,F=108.5,P＜0.01;K562细胞中G2/M期百分率与对照组细胞(5.3％)相比分别增加至(5.8±3.6)％、(15.8±1.4)％、(45.1±4.2)％,F=112.1,P＜0.01;Danu可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导细胞自噬,其中,THP-1细胞中对照组自噬率为5.2％,而Danu浓度梯度处理后分别为(10.4±0.5)％、(16.1±1.7)％和(17.1±1.6)％,F=59.5,P＜0.01.K562细胞中,细胞自噬率分别为(22.7±0.8)％、(23.0±2.6)％和(24.9±4.1)％,与对照组自噬率6.9％相比显著增高,F=30.17,P＜0.01;Danu可以通过线粒体Caspase-3途径诱导细胞凋亡,其中THP-1细胞对照组总凋亡率为5.2％,而Danu浓度梯度处理总凋亡率分别为(10.4±0.5)％、(16.1±1.7)％和(17.1±1.6)％,F=ll.8,P＜0.001;而在K562细胞组中,与对照组(2.4％)相比,Danu浓度梯度处理总凋亡率分别为(11.3±1.8)％、(16.9±1.35)％、(18.4±2.4)％,F=31.6,P＜0.01.结论 Danu可通过抑制极光激酶B有效抑制THP-1、K562细胞生长,同时诱导细胞周期阻滞、凋亡和自噬发生,可做为白血病治疗的靶向小分子抗肿瘤候选药物,为该药物在白血病治疗上的应用奠定重要的理论基础.
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达努塞替通过极光激酶B/核糖体p7OS6蛋白激酶/核糖体蛋白15信号通路调控白血病细胞自噬
目的 探索达努塞替处理人白血病细胞后极光激酶B/核糖体p70S6蛋白激酶/核糖体蛋白15(Aurora B/p70S6K/RPL15)信号通路的变化及细胞自噬的发生情况,并研究其作用机制.方法 选择髓系白血病细胞株THP-1和K562为研究对象.实验分为2部分,第1部分:分别采用0.1μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L浓度达努塞替共培养THP-1和K562细胞,对照组(0μmol/L达努塞替)加入体积分数为2 mL/L的二甲基亚砜(DMSO),以上各组均作用24h;采用四唑盐比色法检测细胞生长的抑制作用,流式细胞术检测细胞自噬情况,Western blot法检测p70S6K、Aurora B、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白(LC3)、Beclin1、核糖体蛋白15(RPL15)的表达水平.第2部分:分别下调THP-1和K562细胞中Aurora B和RPL15,采用DMSO溶解达努塞替(5.0μmol/L),实验分组:DMSO组(空白对照组)、达努塞替处理组、空载质粒组、小干扰RNA (siRNA)组、空载质粒+达努塞替处理组和siRNA+达努塞替处理组.检测自噬信号通路PI3 K/AKT/mTOR中Aurora B、p70S6K、RPL15和自噬蛋白Beclin1、LC3的表达情况.结果 1.达努塞替可抑制THP-1、K562细胞生长,半抑制浓度分别为26.9 μmol/L和30.2 μmol/L.2.在THP-1和K562细胞中,0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L浓度的达努塞替处理细胞后,p-Aurora B/Aurora B、p-p70S6K/p70S6K、RPL15、p-mTOR/mTOR、p-AKT/AKT蛋白表达水平均较对照组降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05);自噬蛋白Beclin1、LC3表达量及细胞自噬率均升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05).3.THP-1细胞中,下调Aurora B后,siRNA组及siRNA+达努塞替处理组p70S6K、RPL15分别低于空载质粒组22.1％、61.3％ (F=18.1,P=0.001)和55.4％、56.1％(F=19.4,P=0.001);LC3表达量较空载质粒组升高13.6％、17.1％ (F=15.4,P=0.001).下调RPL15后,siRNA组及siRNA+达努塞替处理组Beclin1、LC3分别高于空载质粒组39.5％、92.3％ (F =25.2,P=0.001)和40.2％、58.3％ (F =23.9,P=0.001).K562细胞,下调Aurora B后,siRNA组及siRNA+达努塞替处理组p70S6K、RPL15分别低于空载质粒组24.2％、62.7％(F=20.4,P=0.001)和57.2％、60.1％ (F=23.9,P=0.001);LC3表达量较空载质粒组增加17.9％、56.7％(F=20.9,P=0.001).下调RPL15后,siRNA组及siRNA+达努塞替处理组Beclin1、LC3分别高于空载质粒组20.6％、98.4％(F=22.4,P=0.001)和41.5％、70.1％ (F=26.2,p=0.001).结论 达努塞替可能通过影响PI3 K/AKT/mTOR自噬通路来抑制THP-1、K562白血病细胞的增殖,还可负性调控Aurora B/p70S6K/RPL15信号通路引起细胞发生程序性死亡,其中RPL15可能是Aurora B/p70S6K/RPL15信号通路中抑制肿瘤增殖作用的关键靶点.
