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应用抑制性消减杂交技术筛选的肾癌相关基因SIPL1对肾癌细胞生物学功能和耐药的影响
目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选人肾癌差异表达基因,并探讨其对肾癌生物学功能和耐药的影响.方法 从人肾透明细胞癌细胞株RLC-310和正常细胞株HK-2中提取mRNA,应用SSH技术获得肾癌细胞差异表达基因文库,筛选差异表达明显的基因.以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法验证差异表达基因的表达.构建干扰载体沉默人肾癌RLC-310和GRC-1细胞中差异表达基因SIPL1的表达,分别采用细胞计数法、四甲基偶氮唑蓝(MTr)法和裸鼠移植瘤实验检测RLC-310和GRC-1细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,MTT法检测对阿霉素的耐药性.结果 构建了人肾癌细胞差异表达基因文库,筛选了12种差异表达基因,其中SIPL1基因的表达差异为明显.RT-PCR和Western blot法验证SIPL1基因在人肾癌细胞系及肾透明细胞癌组织中高表达.SIPL1 shRNA重组质粒稳定转染至RLC-310和GRC-1细胞后,可明显下调SIPL1蛋白的表达.与转染阴性对照组细胞比较,转染SIPL1 shRNA组细胞的增殖能力均明显下降(P＜0.05),肿瘤形成能力明显减弱[转染SIPL1 shRNA组和阴性对照组RLC-310细胞的裸鼠移植瘤重量分别为(0.22±0.07)g和(0.85±0.06)g,转染SIPL1 shRNA组和阴性对照组GRC-1细胞的裸鼠移植瘤重量分别为(0.32±0.07)g和(1.21±0.11)g,均P＜0.05],Go/G1期细胞的比例增加[转染SIPL1shRNA组和阴性对照组RLC-310细胞中Go/G1期细胞的比例分别为(71.13±4.58)％和(53.27±3.34)％,转染SIPL1 shRNA组和阴性对照组GRC-1细胞中Go/G1期细胞的比例分别为(73.83±3.97)％和(59.33 ±3.03)％,均P＜0.05],对阿霉素的敏感性提高(P＜0.05).沉默SIPL1基因表达可以使AKT通路失活,同时细胞周期抑制蛋白p27Kip1和p21ap1的表达增加.结论 应用SSH技术成功筛选出肾癌差异表达基因SIPL1.SIPL1基因是一个肾癌促进基因,可能成为肾癌诊断和治疗的新靶点.
