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囊袋法兔晶状体上皮细胞体外培养及超微结构观察
目的 建立一种囊袋模型,研究兔晶状体囊外摘除术(ECCE)后残余的晶状体上皮细胞(LECs)在体外增殖、移行、化生的情况.方法 用18只免眼,模拟白内障手术,体外环形撕囊,水分离,去除核与皮质,游离晶状体囊袋,并固定于硅胶环上,置含10%胎牛血清的DMEM营养液中培养3周.相差显微镜观察不同培养时期后囊上LECs增殖、移行情况并行组织病理学、透射电镜检查及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学染色.结果 经过2～3天的潜伏期,后囊周边部开始出现LECs,细胞增殖速度较快,约6～8天可完全覆盖后囊.培养后期,后囊上可出现双层甚至多层细胞,囊膜可见明显皱褶,组织学见均质红染的后囊膜上被覆一层或多层排列紧密、核深染、胞浆丰富的LECs.随培养时间延长,皱褶的数量和长度逐渐增多,囊袋光散增加,后囊张力亦明显增强.透射电镜下LECs排列紧密,周界清晰,胞浆内可见丰富的线粒体及内质网等细胞器.培养1周方可见后囊上LECs α-SMA表达,呈散在胞浆棕色染色,α-SMA表达具有明显时间相关性.结论 应用这种囊袋模型进行LECs体外培养,较为真实的表现了体内ECCE术后多种变化,有助于更深一步探讨后囊膜混浊的发生机制,并为筛选防治后发性白内障的有效药物,提供了有价值的实验手段.
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囊袋法观察兔晶体上皮细胞体外和后囊膜混浊
目的:建立一种囊袋模型,研究兔晶体囊外摘除术(ECCE)后残余的晶体上皮细胞(LECs)在体外增殖,移行,化生的情况.方法:20只兔眼,体外模拟白内障手术,并游离晶体囊袋,固定于硅胶环上,置含10%胎牛血清的DMEM营养液中培养3周.分别用相差显微镜和光镜观察不同培养时期后囊上LECs的生长情况.结果:经过2～3天的潜伏期,LECs开始从囊袋赤道部长出,并在后囊上延伸.细胞增殖速度较快,约6～8天可完全覆盖后囊.培养后期,后囊上细胞层次增多,囊膜出现明显皱褶,且随着培养时间延长,皱褶的数量和长度逐渐增多,囊袋光散增加,后囊张力亦明显增强.组织学可见薄层均质红染的后囊膜上被覆一层或多层排列紧密、核深染胞浆丰富的LECs.结论:应用这种囊袋模型,进行LECs体外培养,较为真实的表现了体内ECCE术后的多种变化,有助于更深一步探讨后囊膜混浊的发生机制,为有效地探讨防止后发性白内障的研究提供了新的培养方法.
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后囊膜混浊的体外上皮-间质转化模型的建立
背景 上皮-间质转化(EMT)是导致后囊膜混浊(PCO)的主要发病机制之一,研究LECs的EMT过程对PCO的防治具有重要意义,但目前缺乏研究EMT的PCO体外细胞模型. 目的 建立新的人晶状体囊外摘出术PCO的体外囊袋培养模型,探讨PCO形成过程中LECs EMT的发生情况.方法 利用健康供体的40只尸眼行体外模拟的白内障摘出术,游离晶状体囊袋后用昆虫针固定于培养皿,置于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养4周,分别于培养后0、3、7、14和28 d在光学显微镜下观察培养囊袋中LECs的生长情况;收集0、3、7和28 d的囊袋组织制备组织病理学切片,采用苏木精-伊红染色法检测囊袋上LECs的细胞形态;采用免疫组织化学染色法检测EMT标志物α-SMA、E-cadherin和Vimentin蛋白在囊袋上LECs中的表达和定位;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测不同时间点囊袋上LECs中α-SMA、E-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白的表达变化. 结果 未进行培养的囊袋后囊膜上未发现LECs生长,囊袋培养后3d可见后囊膜周边出现LECs并逐渐向中央区增生,培养后7 d LECs完全覆盖后囊膜,略呈铺路石样外观并出现皱褶,此后随着培养时间的延长皱褶的数量增多并伸长,囊袋张力增强.免疫组织化学染色结果显示,随培养时间的延长,囊袋上LECs中E-cadherin的表达强度逐渐下降,而α-SMA和Vimentin的表达强度逐渐增强.实时荧光定量PCR检测表明,培养后0、3、7、14和28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量分别为3.35±0.13、1.47±0.20、1.13±0.14、1.00±0.85和0.23±0.03,Vimentin mRNA的相对表达量分别为1.00±0.73、1.05±0.14、2.24±0.43、2.84±0.34和8.570±0.40,α-SMA mRNA的相对表达量分别为1.00±0.06、2.68±0.28、4.24±0.05、2.05±0.90和15.30±0.19,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherin mRNA:F=23.430,P=0.000;Vimentin mRNA:F=8.915,P=0.002;α-SMA mRNA:F=103.500,P=0.000),其中培养后28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量低,而Vimentin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量均高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测结果表明,培养后0、3和28 d囊袋上LECs中E-cadherhin蛋白表达的灰度值分别为1.443±0.017、1.023±0.003和0.568±0.018,Vimentin蛋白表达的灰度值分别为0.565±0.012,1.156±0.007和1.241 ±0.009,α-SMA蛋白表达的灰度值分别为0.195±0.045,0.693±0.036和1.501±0.005,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherhin:F=2 787.000,P=0.000:Vimentin:F=4 488.000,P=0.000;α-SMA:F=1 173.000,P=0.000),其中培养后3、28 d LECs中E-cadherhin蛋白表达明显低于0d,而Vimentin和α-SMA蛋白表达明显高于0d,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究中的新囊袋模型进行LECs体外培养能模拟体内白内障术后晶状体后囊LECs的EMT自然过程,是探讨PCO发生机制和方法新的体外细胞模型.
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甘糖酯对囊袋法培养的兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用
目的 应用甘糖酯(PGMS)抑制囊袋法培养的兔晶状体上皮细胞(LECs)的增生和移行能力,探讨其对后发性白内障的预防和治疗作用.方法 健康纯种白兔30只模拟白内障囊外摘出术(ECCE)建立兔LECs体外培养的囊袋模型,将制备好的囊袋浸泡于不同质量浓度的PGMS中分别作用不同时间.实验组分别用0.2、0.4、0.8g/LPGMS浸泡晶状体囊袋,作用时间分别为2、5、10min,空白对照组晶状体囊袋不用PGMS浸泡.囊袋置于含质量分数5%胎牛血清的DMEM培养液中培养.7d后以囊膜细胞覆盖率作为评价指标,观察兔LECs增生、移行情况;应用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查,观察LECs 的形态及其与晶状体囊袋的结合情况;透射电镜下观察后囊膜上LECs的超微结构.结果 对照组在培养的第3天可见LECs 呈铺路石样生长,第7天后囊膜LECs的覆盖率达100%;各实验组LECs的覆盖率较对照组明显下降(P＜0.05).实验组随着PGMS质量浓度的增加和作用时间的延长,细胞增生、移行的速度明显减慢,其中质量浓度为0.8g/L,作用时间5min和10min组显著抑制兔LECs生长,与对照组和0.2g/LPGMS培养组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).病理组织学检测表明0.4g/L及0.8g/L PGMS作用2min组晶状体后囊膜LECs数目较对照组和0.2g/L PGMS组明显减少,细胞与囊膜连接不紧密.透射电镜下可见对照组和0.2g/L PGMS组LECs结构完整;0.4g/L及0.8g/L PGMS组可见细胞内有较多溶酶体,细胞质空泡样变性等退行性改变.结论 PGMS对囊袋培养的兔LECs的增生、移行的抑制作用呈质量浓度及时间依赖性.
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离体培养晶状体囊袋模型在后囊膜混浊相关研究中的应用
晶状体后囊膜混浊(PCO)又称后发性白内障,是白内障囊外摘出术后常见的并发症,也是术后远期视力下降的主要原因,目前尚无有效的治疗方法,因此寻找切实有效防治PCO的方法备受眼科工作者的关注.长期以来研究者多通过单纯培养LECs来探索PCO发生和发展的机制,虽然加深了我们对其发病机制的了解,但其发生的细胞机制仍不清楚.随着广大眼科学者对PCO发病机制不断的研究和探索,通过体外培养晶状体囊袋模型,能够较为真实地模拟白内障术后晶状体囊膜及细胞生存的环境,便于更好地观察术后在模拟体外微环境下晶状体囊膜及细胞的生物学行为变化规律.本文就囊袋模型的种属来源及其特点、囊袋制备所采用的不同方式及其优缺点、维持囊袋轮廓所采用的不同材料及特点、囊袋模型与在体动物模型相比其具有的优缺点及囊袋模型在PCO相关研究中的应用进行简述.
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生长因子／信号转导通路与后发性白内障
以现代白内障囊外摘除或超声乳化联合人工晶体植入为主流的手术方式，在手术过程中保留了一个囊袋，即部分前囊与一个完整的后囊，为术后常见并发症--后发性白内障（ posterior capsular opacification ，PCO）的发生提供了病理基础［1］。 PCO是残留晶状体上皮细胞（ lens epithelial cells ， LECs）增殖、迁移，转分化为纤维细胞后，在后囊膜视轴区域形成半透明或不透明的膜，造成术后远期视力下降，甚至失明。近年来，各种生长因子／信号转导通路在PCO发生、发展过程中的作用越来越受到人们的重视。细胞培养、体内试验、人／动物晶状体囊袋模型以及尸检等方法，对PCO形成的机制进行了深入的研究［2］。本文对近年来生长因子／信号转导通路对PCO的作用机制所进行的研究作一综述。
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甘糖酯体外对兔晶状体上皮细胞增殖的抑制作用
目的:观察甘糖酯(propylene glycol mannate sulfate,PGMS)对囊袋培养的兔晶状体上皮细胞(RLEC)增殖、移行的抑制作用.方法:新鲜处死的兔眼,模拟白内障囊外摘除术,体外环形撕囊,水核分离,去除核与皮质,游离晶状体囊袋并固定,建立RLEC体外培养的囊袋模型.实验组分别用0.2,0.4,0.8g/L的PGMS浸泡晶状体囊袋,作用时间分别为2,5,10min,同时设空白对照组.上述处理后,囊袋标本置含50mL/L胎牛血清的DMEM营养液中培养.7d后观察RLEC增殖、移行情况并行组织病理学、电镜检查.结果:实验组随着PGMS浓度的增加和作用时间的延长,细胞增殖、移行的速度明显减慢,其中浓度为0.8g/L,作用时间5min和10min两组,显著抑制RLEC生长(P＜0.05).对照组后囊上RLEC增殖、移行速度较快,培养7d后所有标本后囊细胞覆盖率达100%.电镜下对照组细胞结构完整;0.4g/L及0.8g/L实验组细胞退变明显.结论:甘糖酯能有效抑制体外培养的RLEC的增殖和移行.
