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伴放线放线杆菌菌落生长形态变化的观察
目的观察伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)从粗糙型到光滑型的转变过程,识别Aa在实验室传代过程中出现的不同生长形态.方法从牙周炎患者龈下菌斑中分离出的原代菌株8株,应用固体及液体培养基连续传代,液体培养每次传代的同时接种固体培养基观察相应的菌落形态.结果液体培养获得3株光滑型转变株.菌落的变化从粘附的小菌落到沉淀的大菌落到完全的均匀生长,转化过程大约需要7～8代.在这一过程中相应传至固体培养基上生长的Aa从粘附的半透明的小菌落变大、不透明并失去粘附的特性,又随着边缘的扩散变为扁平,透明度也增加;与此同时内部的星形结构逐渐变简单、变小,后消失.固体培养未获得典型的转变株.结论Aa从粗糙型到光滑型的转变是一个菌落湿度逐渐增加,体积逐渐增大,并逐渐失去内部结构的过程.这一过程至少可以看到半透明突起的粗糙型、不透明突起的光滑型和近乎透明的扁平光滑型3种菌落形态.
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伴放线放线杆菌脂多糖诱导下兔不同部位单核巨噬细胞细胞因子表达的差异
目的 探讨伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)脂多糖诱导兔不同部位的单核巨噬细胞细胞因子表达的差异,以期为研究牙周炎与全身疾病间可能的免疫机制提供理论基础.方法 分离5只新西兰兔外周血单核巨噬细胞(peripheral mononuclear cells,Mo)、肺单核巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)、腹腔单核巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM)及肝脏单核巨噬细胞(Kupffer cells,KC),对每个部位的细胞分别用1 mg/L大肠杆菌-脂多糖(大肠杆菌-脂多糖组)、Aa-脂多糖刺激(Aa-脂多糖组),以不加任何刺激的细胞为空白对照组,每组均为6个样本.24 h后采用实时PCR及酶联免疫吸附测定法分别检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)6、IL-1β、IL-8 mRNA及蛋白表达.结果 新西兰兔各部位单核巨噬细胞大肠杆菌-脂多糖组及Aa-脂多糖组4种细胞因子mRNA及蛋白表达均显著高于空白对照组(P＜0.05),其中AM的Aa-脂多糖组TNF-α、1L-6、IL-1β、IL-8 mRNA[分别为(0.4719±0.0171)、(2.7895±0.0669)、(5.1527±0.1190)、(3.6785±0.1836)]及蛋白[分别为(82.2±5.4)、(40.2±2.0)、(50308.3±445.0)、(35 305.3±1480.9) ng/L]的相对表达均强；Aa-脂多糖组4种细胞因子mRAN及蛋白表达均显著强于大肠杆菌-脂多糖组(P＜0.05)；不同部位的单核巨噬细胞对Aa-脂多糖的反应存在部位差异性(P＜0.05),总体上从强至弱依次为AM、Mo、KC、PM.结论 Aa-脂多糖对兔不同部位的单核巨噬细胞各细胞因子的表达存在影响,且这种影响具有部位差异性.
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长春市某小学7～12岁儿童牙周致病菌分布状态调查
目的 应用聚合酶链反应(PCR)法对儿童口腔内牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)分布状态进行检测,探讨检出结果与牙周临床指标之间的关系.方法 选取长春市自强小学151名7至12岁儿童为研究对象,选择右上颌中切牙唇面和右上颌第一磨牙颊面为被检部位,取龈上菌斑、记录探诊出血(bleeding on probing,BOP)、探诊深度(probing depth,PD)、牙龈指数(gingival index,GI),应用PCR法对两菌种进行检测.结果 ①儿童龈上菌斑中Pg、Aa检出率为27.6%、54.3%;②6颊面Pg、Aa的检出率(40.0%、57.9%)均高于1 唇面(15.5%、50.7%),Pg检出率差异有统计学意义(P<0.01),且与BOP、PD、GI呈正相关;③Pg检出率随年龄增长呈逐渐增高趋势,Aa检出率在11～12岁组高,其次为7～8岁组和9～10岁组;④BOP阳性部位Pg、Aa检出率(38.3%、65.4%)均高于BOP阴性部位(23.2%、50.5%),P<0.05.在BOP阳性部位,随PD加深Pg检出率逐渐增高,特别是在PD≥4mm时,Pg检出率明显增高(P<0.05),显示Pg检出率与BOP阳性、PD增加呈正相关.结论 7～12岁儿童龈上菌斑中高频度分布着Pg、Aa;上颌前牙区与磨牙区菌丛构成不同,Pg在磨牙区定植更早;两菌种检出率随年龄增长而增加,且与牙周临床指标密切相关,儿童早期采取牙周病的预防措施是非常必要的.
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伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达
目的 通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin,CDT)的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达,以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得CDT的编码基因cdtABC,通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接,转化感受态大肠杆菌后诱导重组COT蛋白的表达,收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定.结果 pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因,该片段与GenBank中的DNA一致性高达99%.细菌总蛋白中21 000、25 000、32 000左右的蛋白增多,蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白.结论 本研究成功构建了CDT的重组表达载体,并诱导重组CDT蛋白的表达.
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牙周炎患者唾液中伴放线放线杆菌的检出状况分析
目的 检测不同类型牙周炎患者唾液中的伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa),探讨唾液和集合龈下菌斑中Aa检出率的差异以及唾液中Aa的存在状况与牙周临床指标的关系. 方法 收集50例侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis,AgP)患者、48例慢性牙周炎(chronic periedontitis,CP)患者和25例非牙周炎者的非刺激性全唾液和集合龈下菌斑,应用聚合酶链反应(PcR)技术检测两种样本中的Aa. 结果 Aa在AgP患者唾液中的检出率(32%)显著高于非牙周炎者(4%)和CP患者(15%),差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05),同时Aa在AgP患者唾液中的检出率也显著高于集合龈下菌斑样本(16%),差异亦有统计学意义(P<0.05).年龄≤30岁是唾液中存在Aa的危险指征(OR=3.23,P<0.05);出血指数≥3的位点超过70%与唾液中存在Aa有关(OR=19.21,P<0.01). 结论 AgP患者唾液样本中Aa的检出率明显高于集合龈下菌斑样本,亦高于CP患者和非牙周炎者,提示Aa可能参与AgP的发生和发展.
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NF-kB受体激活蛋白配体抗体抑制T细胞介导的牙周骨吸收
目的 通过牙周病动物模型,评价NF-KB受体激活蛋白配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)抗体对T细胞诱导的牙周骨吸收的作用.方法 经鼠尾静脉回输体外分离、纯化、扩增的T淋巴细胞,牙龈局部微量注射T细胞特异性抗原,形成牙周病动物模型,实验前1d及实验第1、3d,在牙龈同样部位注射不同浓度RANKL F(ab′)2抗体片段进行干预.酶联免疫吸附测定法检测血清中鼠抗兔IgG抗体水平及牙龈组织中可溶性RANKL( soluble RANKL,sRANKL)的表达水平；显微镜下测量上颌磨牙牙槽骨吸收；抗酒石酸酸性磷酸酶染色法测定牙槽骨表面破骨细胞的形成.结果 鼠牙周病模型经RANKL抗体干预后,小剂量抗体(0.015、0.15及1.5μg/鼠)不产生免疫性,与实验当天相比差异无统计学意义(P＞0.05)；高浓度组(10μg/鼠)在实验后7、10 d测得的血清中鼠抗兔IgG A405值分别为0.64 ±0.12及0.55±0.03,差异有统计学意义(P＜0.01),可产生明显的免疫反应；牙龈组织匀浆液中sRANKL的表达水平及牙槽骨吸收明显减少,除0.015 μg组与对照组相比差异无统计学意义外,其他浓度抗体组牙龈组织中sRANKL的表达水平(由279.11±19.32分别降至146.03±11.21、118.24±20.52、110.72±7.11)及牙槽骨吸收率(由20.83±0.78分别降至15.95±1.21、12.72±0.82、12.61±0.79)均明显减少,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；牙槽骨表面的破骨样细胞数也明显减少[由(83.57±7.73)个/mm减少至(58.07±9.57)个/mm],抗体组与非抗体组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；牙龈组织中RANKL的表达与牙周骨吸收呈显著正相关(r2 =0.995,P＜0.01).结论 RANKL抗体可通过减少RANKL的表达水平,直接阻断RANKL的作用,抑制T细胞诱导的牙周骨吸收.
关键词： NF-κB受体激活蛋白配体 放线杆菌 伴放射菌 牙周骨吸收 -
慢性牙周炎患者抗伴放线放线杆菌IgG滴度改变的临床意义
目的:明确慢性牙周炎(chronic pefiodontitis,CP)患者血清抗伴放线放线杆菌(Aggregatibacter actinomyce-temcomitans,Aa)血清c型的抗体反应并探讨其与牙周临床指标的关系.方法:采集30例CP患者和45例牙周健康者的空腹静脉血,同时收集CP患者的龈下菌斑和非刺激性全唾液用于Aa的检测(PCR方法),应用酶联免疫吸附方法(ELISA)测定血清中抗Aa血清c型IgG抗体滴度.结果:CP组和健康对照组血清抗Aa血清c型抗体检出率均为100%.CP组IgG抗体滴度高于健康对照组,差异有统计学意义[(10.9±1.9) vs (9.1±1.8),P=0.000];同时CP组抗体滴度升高率也高于健康对照组,差异有统计学意义(23.3% vs O%,P=0.003).龈下菌斑或唾液Aa检出阳性的7例慢性牙周炎患者血清IgG抗体滴度(12.6±1.6)高于Aa阴性患者(10.4±1.7),差异有统计学意义(P=0.005).CP患者血清抗Aa IgG抗体滴度与全口平均探诊深度呈正相关(r=0.344,P=0.068).结论:血清c型为CP患者定植的Aa的重要血清型;CP患者血清抗Aa抗体并非简单的保护作用.
