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转染猿猴空泡病毒40大T抗原基因无限增殖化大鼠牙囊细胞的实验研究
目的 以猿猴空泡病毒40大T抗原基因( simian virus 40 large tumor antigen,SV40Tag)转染SD大鼠牙囊细胞(rats' dental follicle cells,rDFC)构建无限增殖化rDFC,以期为牙周组织工程研究提供稳定的细胞来源.方法 分离SD大鼠下颌第一磨牙牙胚,组织块法分离培养原代rDFC,免疫组织化学技术鉴定细胞来源.利用脂质体介导含有SV40Tag的质粒pSSR69-pAmpho转染293细胞,取病毒上清液感染rDFC,潮霉素筛选,阳性克隆扩大培养(无限增殖化组)；以未转染细胞作对照组,观察细胞形态,计算细胞群体倍增时间,绘制细胞生长曲线和倍增曲线.反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测rDFC中SV40Tag基因的表达,蛋白质印迹法检测端粒酶表达,计算平板克隆形成率,行软琼脂克隆形成实验及细胞致瘤性实验.对无限增殖化组和对照组细胞群体倍增时间采用两独立样本t检验,对两组细胞平板克隆形成率采用两独立样本率x2检验.结果 无限增殖化rDFC形态与正常rDFC形态无明显差别.无限增殖化rDFC中SV40Tag RT-PCR结果显示在357 bp处有一条特异扩增条带,未转染细胞未见条带,无限增殖化rDFC端粒酶表达显著高于正常细胞.两组rDFC生长曲线无明显差异,倍增曲线显示无限增殖化组rDFC保持了较强的增殖能力.无限增殖化rDFC平板克隆形成率[34％( 33/96)]高于对照组[22％(21/96)],但差异无统计学意义(x2=3.71,P＞0.05),软琼脂内不能形成克隆；两组细胞致瘤性实验均未见肿瘤形成.结论 SV40Tag基因无限增殖化rDFC能在体外长期培养并多次传代,具有相对稳定的增殖特性和功能状态,为良性转化,有望进一步应用于牙周组织工程研究.
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转导hTERT基因致人骨髓基质细胞永生化及向神经元样细胞诱导分化的研究
目的建立永生化的人骨髓基质细胞(hMSC)系,以供神经外科临床和基础研究使用.方法原代培养人骨髓基质细胞,采用含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的逆转录病毒载体上清感染hMSC,经筛选得到阳性克隆,在体外进行连续培养.应用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测hTERT基因的整合及表达情况,并用10%β-巯基乙醇(β-ME)、反式维甲酸(RA)、Forskolin和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对转化后的hMSC-hTERT细胞进行诱导,使其向神经元样细胞分化.结果外源性hTERT基因在DNA、RNA和蛋白质水平均有表达,诱导后的hMSC-hTERT细胞表达神经元特异性标志物神经核蛋白(NeuN)和βⅢ微管蛋白(Tubulin-βⅢ).hMSC-hTERT细胞至今已传至82代.结论外源hTERT基因在hMSC细胞中稳定整合并表达,永生化的hMSC细胞系成功建立:在一定诱导条件下,永生化的hMSC细胞能够在体外分化成神经元样细胞.
