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改良扩孔介孔硅介导大鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化
目的 探讨自制的扩孔介孔硅纳米粒子(LPMSNs)的材料性能,及其对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨向分化的影响.方法 溶胶凝胶法合成介孔硅纳米颗粒(MSNs),使用扩孔剂1,3,5-三甲苯(TMB)对初始合成的小孔径高温扩孔.透射电镜(TEM)、N2吸附解吸附、孔径分布、孔容及比表面积分析、傅里叶红外光谱(FTIR)、热重分析(TGA)检测其形貌结构和理化性能.体外分离培养BMSCs,并对其增殖能力和多向分化潜能进行鉴定,取第3代细胞用于实验.配置不同浓度LPMSNs培养液,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测LPMSNs的细胞毒性.分为对照组、LPMSNs组(10 μg/mL),培养21 d后,茜素红染色法检测各组细胞矿化结节.培养7、14 d后,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Runx相关转录因子(Runx2)、骨钙素(OCN)表达.培养14 d后,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测成骨相关蛋白水平表达.使用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和t检验比较,以P＜0.05认为差异有统计学意义.结果 TEM显示LPMSNs粒径约为200 nm,其N2吸附解吸附曲线为Ⅳ型等温线,有吸附的迟滞环;LPMSNs的孔径分布图显示其孔径分布峰值为7.39 nm,BET比表面积图计算出来的BET比表面积为(340.5 ± 2.8)m2/g,BJH孔容为1.8 cm3/g.在LPMSNs的FTIR的数据中,可观察到位于460 cm-1的Si-O-Si横向摇摆振动峰(TO1);位于800 cm-1的Si-O-Si对称伸缩振动峰(TO2);位于1070 cm-1的Si-O-Si非对称伸缩振动峰(TO3),位于940～960 cm-1的Si-OH键振动峰,位于3000～3700 cm-1的-OH振动峰.TGA显示LPMSNs在28～1000℃之间整个失重所占百分比约为1.61%.CCK-8法结果显示低浓度(＜20 μg/mL)的LPMSNs对细胞活力无明显影响.茜素红染色法显示与对照组相比,LPMSNs组的细胞矿化结节形成数量较多,体积较大.实时荧光定量PCR结果表明,LPMSNs组7 d时ALP表达量(6.2 ± 1.9)与对照组相比显著提高(t=4.83,P=0.0085),Runx2表达量(4.3 ± 0.6)与对照组相比显著提高(t=9.76,P=0.0006);14 d时ALP表达量(19.2 ± 1.4)与对照组相比显著提高(t=4.86,P=0.0083)、Runx2表达量(4.9 ± 0.7)与对照组相比显著提高(t=7.73,P=0.0203)、OCN表达量(17.2 ± 3.6)与对照组相比显著提高(t=5.52,P=0.0052).Western blot的结果显示,成骨分化的第14天,LPMSNs组的Runx2相对表达量(1.7 ± 0.3)与对照组相比呈上升趋势(t=3.48,P=0.0254);OCN相对表达量(1.69 ± 0.21)与对照组相比显著提高,差异有统计学意义(t=5.71,P=0.0047).结论 本研究制备LPMSNs具有较大的比表面积、孔容和亲水性,适用于负载较大分子量的蛋白或细胞因子,细胞毒性小,可促进大鼠BMSCs成骨向分化,作为骨缺损的修复材料具备一定的应用价值.
