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CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达
目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚.本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达载体,以实现这些基因在真核细胞中的高效表达,为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础.方法:从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA,以此为模板,采用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)获得CHIP全长编码基因,经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tag1中,并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box(-).结果:钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致,瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达.结论:成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体,为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础.
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RPAP3蛋白中TPR结构域的功能研究
目的:构建针对RPAP3 TPR区域的慢病毒载体,观察过表达对细胞周期的影响.方法:通过生物信息学软件比较RPAP3结构域组成,推测功能；分析RPAP3核定位信号,构建瞬时表达质粒pEGFP-N2-RPAP3,激光共聚焦显微镜观察RPAP3蛋白的亚细胞定位；通过酵母双杂交和GST-Pulldown实验研究RPAP3与HSP70的相互作用度作用靶点；构建慢病毒载体pLJM.1 -RPAP3,转染293T细胞,收病毒感染MCF7细胞,嘌吟霉素筛选获得稳定转染细胞系,流式细胞分析对细胞周期的影响.结果:RPAP3在多物种广泛存在,有高度保守性；蛋白存在典型核定位信号,激光共聚焦显微镜下,GFP标记的RPAP3蛋白主要分布在细胞核；酵母双杂交和GST-Pulldown实验证实RPAP3与HSP70间存在相互作用,且作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和HSP70的GPTIEEVD末端之间；流式细胞显示RPAP3 TPR区域的高表达阻滞细胞周期且凋亡增加.结论:RPAP3与HSP70间的相互作用发生在RPAP3的三联TPR结构域和热休克蛋白70的GPTIEEVD末端之间；构建高表达细胞株发现其对细胞周期及凋亡有影响.
