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IL-1ra-Fcε融合分子的构建及其在293T细胞中的表达与鉴定
目的:构建IL-1ra-Fcε融合基因的真核表达载体pCI-neo-IL-1ra- Fcε,研究其在体外的表达情况.方法:利用RT-PCR方法从哮喘大鼠脾细胞中克隆大鼠IgE 恒定区cDNA,同时从载体pBV220-IL-1ra中克隆IL-1ra基因.利用重叠延伸PCR技术合成了IL-1ra-Fcε融合基因.将其克隆入真核表达载体pCI-neo,以脂质体法转染293T细胞,G418筛选稳定表达细胞株.利用Western印迹、RT-PCR验证融合蛋白的表达,并在EL-4/CTLL-2细胞中对融合蛋白活性进行了验证.结果和结论:成功构建了pCI-neo-IL-1ra- Fcε表达载体,Western 印迹、RT-PCR验证融合蛋白在293T细胞得到表达,并获得了稳定表达IL-1ra- Fcε的细胞株.表达的融合蛋白在体外具有拮抗IL-1的功能.为过敏性哮喘基因治疗奠定了基础.
关键词： IL-1ra-Fcε融合基因 转染 真核表达 鉴定 -
IL-1ra-Fcε融合基因在大鼠体内表达条件优化及免疫原性分析
目的 探索基因治疗载体pCI-neo-IL-1ra-Fcε 在大鼠体内的适表达条件及免疫原性.方法 采用气道滴注方式将 pCI-neo-IL-1ra-Fcε载体滴注至大鼠肺部,利用RT-PCR及Western blot方法检测不同剂量(0.25、0.5、2.5 mg·kg-1)载体在不同时间(d 4、d 7、d 20)的表达量,并采用免疫组化方法进行验证.间接ELISA法检测滴注后IL-1ra-Fcε蛋白IgG抗体变化,并对IgG抗体亚型IgG2a和IgG1进行分析.结果 3种不同剂量载体在滴注后d 20均可检测到目的 蛋白表达,2.5 mg·kg-1组蛋白表达量明显高于另外2组; 以0.25 mg·kg-1剂量滴注载体,目的 基因d 4时未见表达,d 7时表达量增加,d 20时达到大值;免疫组化结果显示IL-1ra-Fcε基因在大鼠肺组织中得到有效表达.结论 成功建立pCI-neo-Ira-Feε载体在大鼠体内适表达条件,此载体可诱导机体产生Th1型免疫应答.
