首页 > 文献资料
-
IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究
目的:构建新型高效真核表达载体,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶(Iin-UK)在CHO细胞中的高表达.方法:利用常规分子生物学方法,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化,构建了一系列新型真核表达载体,以Iin-UK融合基因为目的基因,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力,然后挑选高表达的克隆,通过MTX加压扩增,以提高Iin-UK融合基因的拷贝数及表达水平.结果与讨论:构建了5种新型真核表达载体,并筛选出优化的真核表达载体,通过MTX加压扩增,实现了Iin-UK融合基因在CHO细胞中的高表达,表达量达到10 μg/(106细胞·24h ).
关键词： 真核表达载体 neo基因 CHO/dhfr-细胞 重组蛋白 高表达 -
CHO细胞高效表达载体的优化
目的:研究分析中国仓鼠EF1-α基因的转录调控序列,以构建新型高效表达载体.方法:利用常规分子生物学技术,构建了一系列基于CHEF1-α基因的非翻译区调控序列元件的新型真核表达载体.以组织型纤溶酶原激活剂突变体(k2tPA)作为报告基因,利用本室已建立的CHO-dhfr--Z+定点整合表达系统比较载体表达外源基因的能力,挑选表达量高的载体.进一步添加翻译增强子(H213及V163)序列,再进行评价.结果:CHEF1-α5'UTR及启动子+3'UTR 1.65 kb、CHEF1-α5'UTR及启动子+3'UTR 2.7 kb这2种组合均可有效提高目的基因tPA的表达,表达效率与对照载体相比分别提高了65.9%和54.5%.在添加翻译增强子V163后,载体pMCEdEF53Ⅲ-163frt-k2tPA的表达效率为对照载体的2.65倍.结论:该载体系统在重组蛋白药物的研发方面具有良好的应用前景.
-
新型CHO/dhfr-细胞定点整合和表达系统的建立
目的:建立CHO/dhfr-细胞的定点整合和表达系统.方法:利用常规分子生物学方法,构建了一个新的高效筛选表达载体,该载体含有一个由FRT(flp recombination target)位点、报告基因(LacZ)及筛选基因(zeocin)三片段构成的融合基因,而且该基因的表达受一个弱化的SV40启动子的控制.借助于随机整合及高效筛选,实现FRT位点在CHO/dhfr-细胞基因组中转录活跃区的整合,然后利用该位点介导的特异性重组实现了目的基因(单链抗体-尿激酶融合基因)的定点整合和有效表达,而且随后通过DHFR/MTX系统的加压扩增,以提高单链抗体-尿激酶融合基因在宿主细胞中的表达水平.结果与结论:获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系,并利用该细胞系实现了单链抗体-尿激酶融合基因的高表达,表达量达到5 μg/(106细胞·24 h).
关键词： CHO/dhfr-细胞 flp-FRT重组系统 定点整合 基因表达 -
人溶菌酶cDNA克隆与CHO/dhfr-细胞中的分泌性表达
目的 探讨人溶菌酶(hLYZ) cDNA的克隆及在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-)中的分泌性表达.方法 采用RT-PCR的方法,从人胎盘组织中克隆hLYZ cDNA,构建hLYZ真核分泌性表达载体,科用脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选得到表达hLYZ的CHO抗性细胞株.结果 hLYZ基因成功连接到真核分泌性表达质粒pSecTag2/HygroB上,hLYZ融合蛋白在二氢叶酸还原酶/CHO-k1表达系统中得到成功表达.结论 成功构建真核可溶性表达载体pSecTag 2/Hypro-hLYZ,为规模化、工程化生产hLYZ奠定基础.
关键词： 人溶菌酶 CHO/dhfr-细胞 真核表达 脂质体共转染 -
人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达
目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体，并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段，将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr，得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr；经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系；用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并建立了稳定转染的CHO细胞系，成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。
关键词： 人肠三叶因子 真核表达载体 CHO/dhfr-细胞 -
糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1融合蛋白在CHO/DHFR-细胞的稳定表达
目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1(GPI-B7-1)的CHO/DHFR-细胞表达体系.方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3-GPI-B7-1和pSV40-DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westen blot检测.结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株.膜蛋白经Western Blot检测具有生物活性.结论 GPI-B7-1在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础.
关键词： GPI-B7-1 CHO/dhfr-细胞 真核表达 -
用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究
目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体.方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI-neo的MCS中,构建表达载体pCI-FRT-HBsAg.以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆.检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+.将表达质粒pA-FRT HFLF和pOG44以1:9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+.转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测.筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆.在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其后的表达量为5mg/L.对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Western blot和抗原结合活性的检测.结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L.结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础.
关键词： 定点整合 FRT CHO/dhfr-细胞 基孔肯亚病毒 嵌合抗体
