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Bacteroides coprocola菌 β-葡萄糖苷酶基因的表达纯化及活性测定
目的 构建一种拟杆菌Bacteroides coprocola(BC)β-葡萄糖苷酶基因的原核表达载体,并纯化该 β-葡萄糖苷酶,检测其水解不同底物的能力.方法 以NCBI数据库中提供的BC菌 β-葡萄糖苷酶基因序列为参考,合成出该基因的全长序列,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-4T-1中;以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western印迹检测 β-葡萄糖苷酶基因的表达,并通过不同底物检测其活性及比较各法的优劣.结果 PCR扩增结果与双酶切实验表明,原核表达载体构建成功;Western印迹结果显示,β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中特异表达;酶活性实验表明,该菌 β-葡萄糖苷酶在对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(4′-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside,pNPG)和京尼平苷(geniposide)中均有活性,且用pNPG作为底物测定的活性结果更可靠.结论 用两种底物成功检测出纯化的BC菌 β-葡萄糖苷酶的活性,为进一步研究其功能奠定了基础.
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千里光β-葡萄糖苷酶基因(ScBG1)的序列特征与表达分析
目的:探讨千里光β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)基因(ScBG1)的序列特征及表达与抗菌性状的关系.方法:利用生物信息学软件分析千里光BG蛋白的序列特征、结构域,通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测ScBG1基因在不同抗菌性状的亲本及其杂交F1代的转录累积水平.结果:千里光BG蛋白一级结构由459个氨基酸残基构成,C端保守基元序列是该蛋白的功能结构域;亚细胞定位分析结果显示BG蛋白分布于细胞质膜、线粒体膜和线粒体膜间腔;ScBG1基因转录累积水平与抗菌性状呈正相关.结论:千里光β-葡萄糖苷酶催化产物参与抗菌性状的次生代谢信号传导网络,其抗菌生理功能表现为核基因组与线粒体基因组共同控制的数量性状.
