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重组CPTα的亲和纯化及其单克隆抗体的制备
目的: 制备抗A型产气荚膜梭菌毒素α(CPTα)单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性.方法:利用工程菌株E.coli M15/pQE30-CPTα表达的重组A型CPTα带有6个组氨酸(6×his)标签的特性, 经Ni-NTA螯合亲和层析方法纯化后,用纯化的重组CPTα免疫BALB/c鼠,以常规杂交瘤细胞融合技术、HAT选择性培养和间接ELISA进行筛选,并分析其亚类及中和保护作用.结果: 获得一株能稳定分泌抗CPTα的mAb杂交瘤细胞株4E2,其分泌抗体亚类为IgG1.该mAb与重组CPTα和天然CPTα均可发生特异性反应,并可保护小鼠抵抗2倍小致死剂量CPTα的攻击,属中和性抗体.结论: 应用纯化的重组CPTα成功地获得了特异性的中和抗体mAb 4E2,为A型CPTα诊断抗体和治疗性抗体的研制奠定了基础.
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A型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆及高效表达
目的:实现产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha toxin,CPa)基因的克隆与表达.方法:用PCR技术从A型产气荚膜梭菌中扩增出CPa基因,克隆到原核表达载体pQE30中,构建了重组质粒pQE30-CPa,转化E.coli M15获得了CPa的高效表达.结果:序列测定和双酶切表明,CPa基因正确插入载体.序列分析发现CPa基因与GenBank中的4种CPa基因相似率为76.7%～99.9%.工程菌裂解液经SDS-PAGE分析显示在相对分子质量43?000处有一条表达很强的蛋白区带,与CPa相对分子质量相符,约占菌体总蛋白的62.88%,主要以包涵体形式存在.免疫印迹结果表明, 表达的重组CPa蛋白同抗CPa血清有特异性结合.结论:为进一步研究CPa重组疫苗和制备CPa的特异性抗体奠定了基础.
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荧光定量PCR法检测小鼠肠道中产气荚膜梭菌的实验研究
目的 建立一系列浓度梯度的A型产气荚膜梭菌(clostridium perfringens,C.perfringens)感染小鼠肠道的动物模型,探讨实时荧光定量PCR法对肠道中C.perfringens的检测.方法 小鼠随机分成6组,每组10只,依次腹腔注射浓度为5.7×109、5.7×108、5.7×107、5.7×106和5.7×105 cfu/mL的A型C.perfringens菌液1 mL,空白对照组腹腔注射生理盐水1 mL.连续观察72 h,统计小鼠死亡数量、存活时间及腹腔取样做细菌革兰染色涂片镜检、细菌厌氧血平板厌氧培养、测序鉴定和荧光定量PCR定量检测.结果 细菌镜检结果 为5.7×109、5.7×108 和5.7×107 cfu/mL浓度组在显微镜下能观察到两头钝圆棒状的革兰阳性杆菌,细菌厌氧培养能培养出大量边缘粗糙的菌落;在5.7×106、5.7×105 cfu/mL浓度组和空白对照组不能发现革兰阳性杆菌,利用细菌培养法,5.7×106 cfu/mL组平均能培养出7个菌落,在5.7×105 cfu/mL组和空白对照组不能培养出任何菌落,克隆目的 片段测序结果 与GeneBank中C.perfringens16S rRNA[AB566417]完全一致.荧光定量PCR法在各浓度组为阳性,空白对照组为阴性.结论 荧光定量PCR法在检测C.perfringens具有灵敏度高、特异性好、检验时间短的优点.
